第六章++转基因动物详解.pptVIP

湖南师范大学生命科学学院 袁 婺 洲 6.1 动物转基因技术 显微注射法 逆转录病毒法 胚胎干细胞法 精子载体法 体细胞核移植法 6.2 提高转基因效率的策略 6.3 转基因动物的应用 转基因动物在生命科学基础研究中的应用 转基因技术在动物育种中的应用 转基因动物在医药科学研究中的应用 6.4 转基因动物研究存在的问题及展望 转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之在受体染色体上稳定整合，并能把外源目的基因传给子代的个体，叫转基因动物（transgenic animals） 第一节 动物转基因技术 1 显微注射法 2 逆转录病毒法 3 胚胎干细胞法 4 精子载体法 5 体细胞核移植法 一. 显微注射法 在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法。 1、目的DNA的准备 构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控序列，加尾信号。 线性DNA分子的准备 DNA浓度：1-3μg/ml . 2、小鼠的准备和要求 超排受精卵的准备： 选择4－6周龄的小鼠，用孕马血清促性腺激素素（PMSG）和人绒毛促性腺激素（hCG）先后进行腹腔注射，做超数排卵处理； 注射后10－13小时超排卵，每个母鼠与一个公鼠交配。 假孕母鼠的准备： 通过注射PMSG和hCG诱导产生，再与结扎的公鼠交配。 3、受精卵的分离 处死经超排处理的小鼠，从输卵管膨大部位取出受精卵 解散卵丘细胞,清洗受精卵 在显微镜下确认和选择受精卵。 4、显微注射 将受精卵置于培养皿或玻片的液滴内，用吸持针吸住受精卵；将外源基因注入受精卵的雄原核内。 5、受精卵的移植 将假孕小鼠麻醉，在腹部下方与最后一根肋骨平行的地方开一个小口，在输卵管壶口处用微吸管将注射过的受精卵移入，缝合伤口。按常规饲养，20天前后，后代幼鼠将产出。 6、转基因小鼠的鉴定 PCR Southern blot Northern blot Western blot 标记性状 显微注射法的效率 每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有大约25%左右的幼鼠是转基因鼠。 理想情况下，30－50/1000 一般情况下， 1/1000 提高目的DNA的整合率与表达率 7、 显微注射法的不足 外源基因整合效率低； 随机整合或随机插入，存在插入突变的风险 方法复杂，技术性强，设备昂贵等。 （1）逆转录病毒的结构 （2）逆转录病毒的基因组 基因组长9kb， LTR细分为5’-u3-R-u5-3’。其中u3区包含病毒的增强子和启动子序列，R区包含一个Cap区。u5区包含聚腺苷酸加尾信号。5’LTR的3’边界区是引物结合位点（PBS）。U5的下游还有ψ序列，包装识别信号。 (3) 逆转录病毒的生活周期 病毒侵入细胞； 病毒的RNA基因组在细胞质中反转录成双链的前病毒DNA(复制形式DNA)； 前病毒DNA被传送至细胞核，并最终整合到宿主染色体上； 整合后的前病毒DNA进而使用宿主细胞的RNA聚合酶转录自己； 最后，部分转录的信息被翻译成病毒蛋白质，组装成新的病毒。 受体 吞噬 脱外壳 逆转录 核蛋白复合体 有丝分裂 复合体进入核 病毒DNA－蛋白复合体中含有由一个病毒DNA的pol基因所编码的内切酶，在此酶的作用下，宿主染色体被切开，而病毒的染色体得以嵌入。此过程发生在细胞有丝分裂的S期。 嵌入后的前病毒被细胞的RNA聚合酶II转录为病毒RNA，其蛋白质表达完全依赖于细胞的蛋白质合成机构。 (4) 逆转录病毒载体的构建 为了保证逆转录病毒载体的感染功能，建立包装细胞，在包装细胞里表达三个逆转录病毒的结构基因。所以首先让携带有外源目的基因的逆转录病毒载体感染包装细胞，在包装细胞中被包装成新的子代病毒颗粒，再去感染动物宿主细胞。 （5）逆转录病毒介导转基因的优势 逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，也可感染稍晚阶段的不同发育时期的胚胎； 高效率感染并能在宿主细胞DNA上高度整合，可以大大提高基因的转移效率。 但这一高的感染率绝对依赖于细胞的两个特性：一是细胞要具有逆转录病毒的受体，二是目标细胞需要进行细胞分裂。二者缺一不可。 （6）逆转录病毒的安全性问题 虽然逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，感染效率高，并能在宿主细胞DNA上高度整合，但只可以转移小片断的小于10kb的DNA。而且存在安全隐患。如逆转录病毒在靶细胞染色体上的整合可能造成： 1）破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因 2）LTR激活原癌基因 3）染色体重排激活原癌基因 三. 胚胎干细胞法 胚胎干细胞（e