第三章基因工程的酶学基础精要.ppt

（4）、外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型 1 外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 4 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5 3.??外切酶活性特点 1 反应底物：互补ds-DNA 2 碱基释放速度：C A-T G 3 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.??用途 1 核酸（DNA）标记 2 基因突变----缺失 3 DNA序列测定时作顺序缺失 5.??使用注意事项 1 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区 来自于cDNA加尾 （5）、Rnase（6）、RNaseH RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1. RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。 （7）、 DNase I 1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 2. 用途 1 切口移位，制备DNA探针 2 制备RNA样品时除去DNA分子 3 基因突变时产生切口 取代合成法优于缺口转移法： （ 1 ）、不会出现发夹结构而缺口转移制备的探针会出现这种结构； （ 2 ）、应用适宜的核酸内切限制酶切割，便可很容易的变成特定序列的探针。 具EcoR1位点的DNA分子 对DNA分子3‘端有控制的降解 合成作用产生选择性标记 T4DNA聚合酶的取代合 成法标记DNA断末端及 制备链的特异探针 ４、反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。 具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5’突出末端的DNA片断作末端标记。 合成cDNA的主要步骤： （ 1 ）、应用poly A mRNA为模板，以12～18个碱基长的oligo dT 片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链; （ 2 ）、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成； （ 3 ）、用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。 （ 4 ）、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。 5. T7DNA聚合酶： 1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。 具有5’ 3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’ 5’核酸外切酶活性。 T7DNA聚合酶的用途： （ 1 ）、用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸） （ 2 ）、 通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端 （ 3 ）、 将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。 6. 修饰的T7DNA聚合酶 对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’ 5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。 用途： （ 1 ）、作为一种DNA序列分析的工具酶： 加工性能高；无3’ 5’的外切酶活性； 具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。 （ 2 ）、制备探针；可催化较低水平的dNTP （ 0.1 μmol/L ）参入。 （ 3 ） 、有效的填补和标记具有5’突出末端 的DNA片断的3’-末端。 聚合作用高；失去了3’ 5’的外切酶活性 4．其他酶 1、末端核苷酸转移酶（terminal tran