第十五章病毒病的分子生物学诊断.docVIP

第十六章 病毒病的分子生物学诊断 一、概述 二、病毒基因的克隆与鉴定 三、病毒基因探针的制备 (一)病毒基因探针的种类 (二)病毒基因探针的标记 四、核酸杂交检测技术 (一)建立杂交体系 (二)核酸打点杂交 (三)核酸酶保护分析法 (四)核酸原位杂交 五、PCR扩增技术 (一)诊断PCR技术的设计策略 (二) PCR用于DNA病毒的检测 (三)PCR用于RNA病毒的检测 (四)PCR用于分子流行病学研究 六、限制性内切酶图谱和寡核苷酸指纹图 (一)病毒基因组的限制性内切酶图谱 (二)病毒寡核苷酸指纹图(Oligonucleotide fingerprinting) 七、病毒核酸序列测定 一、概 述 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学的进步，大大提高了病毒病的诊断水平。病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测，进入到可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸(DNA或RNA)和蛋白质等的测定，关键在于测定这些分子的特异序列或结构。病毒基因组往往含有特异序列，可以用核酸杂交的方法予以检出，而这段序列的存在则说明了该病毒的存在。 虽然病毒是严格细胞内寄生的最小、最简单的生命形式，但也具有与宿主细胞不同的独特的核酸序列和基因结构。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)等。其中核酸杂交和PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断中最具应用价值的方法。DNA杂交的灵敏度已经提高到0.05pg/μl水平，也就是说，只要有1 000个DNA拷贝，就可能被检测出来。使用PCR甚至可以检测出一个拷贝的DNA分子。 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。现已发现某些病毒与宿主细胞或与其它病毒之间存在着同源的核酸序列，因此在建立分子杂交或PCR诊断方法时，需要了解基因片段的核苷酸序列，获得病毒特异的片段。在这一片段上标记放射性同位素或非放射性物质(如地高辛、生物素等)作为探针,就可建立分子杂交诊断方法;也可根据这一片段的核苷酸序列，设计一对特异引物，应用PCR技术扩增这一片段。获得病毒特异DNA片段的基础是进行病毒基因的克隆，即首先建立易于获得足够量病毒DNA的病毒基因无性繁殖系。病毒基因克隆以后，就可以比较容易地用酶促法或化学法来测定其核苷酸序列，再将获得的序列输入计算机，与基因序列库中的己知序列进行比较分析，就能准确地定位病毒特异的基因序列。到目前为止，越来越多的病毒基因被克隆和测序，几乎涉及所有动物病毒科的成员，一些重要病毒的全基因序列已被测定，这无疑促进了病毒病分子生物学诊断技术的发展。 二、病毒基因的克隆与鉴定 病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的。可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体作为载体，但最常应用细菌质粒载体，在大肠杆菌(E.coli)中进行。用于基因克隆的质粒必须具备3个主要结构特征：1.具有负责其在宿主细胞中自主复制的复制起始区(Ori)；2.具有克隆后便于筛选的标记基因(如对各种抗生素的抗性基因等)；3.含有外源基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/pUC19和pBR322等。pUC18/pUC19为高拷贝质粒(120～200个／细胞)，含有多克隆位点，以可满足多种内切酶切割的DNA片段的克隆；pBR322为中拷贝质粒(50～80个／细胞)。 病毒基因克隆的目的在于：1.病毒基因片段的大量制备；2.序列分析；3.基因表达与调控研究；4.构建病毒载体；5.制备核酸探针等。病毒的基因组有DNA和RNA以及双链和单链之分。在着手进行基因克隆前，了解目的病毒的核酸类型是必要的。对不同类型的病毒，采用不同的基因克隆方法:DNA病毒可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；RNA病毒则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；反转录病毒可从感染细胞中提取前病毒DNA，随后再行克隆。总的来说，病毒基因的克隆包括以下几种类型： 单链DNA病毒的基因克隆 主要指细小病毒科成员。这类病毒的基因组为单链线状DNA,两端因回文序列而形成发夹结构，这一结构是病毒基因组复制的引物，因此在感染过程中，病毒基因组可在宿主细胞内形成双链DNA形式的中间复制型DNA。提取这种复制型DNA，用单链核酸酶去除两端的发夹结构，就可对该病毒全基因组进行克隆;也可用适当的内切酶切割后，回收所需的片段进行克隆。 双链DNA病毒的基因克隆 绝大多数的动物致病性DNA病毒含有双链DNA基因组,但是它们之间的差别较大。对于较小的双链DNA病毒，如SV40、乙型肝炎病毒等，它们的基因组为环状双链DNA。在克隆时，使用对这些环状DNA