细胞复苏培养传代冻存细胞计数和MTT精要.pptVIP

细胞复苏、培养、传代、冻存、细胞计数和MTT 细胞复苏 细胞冻存管从-80℃取出，迅速置于37℃水浴锅中于1min内迅速融化至室温。 培养 于操作台内混匀后吸出冻存细胞液移至15ml离心管中，1500 rpm 3 min(1000 rpm 5 min)。吸弃培养液，加入新鲜培养液，重悬混匀。 向新培养瓶中加入新培养液铺满瓶底后取重悬液加入其中，于37℃ 5%CO2中培养。 传代 将80%汇合或刚汇合的细胞，PBS洗2次吸弃后，加入TRY消化，翻转观察当消化液消化至细胞间隙变大或呈沙状流下时加入2~3倍体积的培养液终止消化。将细胞冲刷下混匀后，移至15ml离心管1500rpm离心3min。 吸弃培养液，重悬混匀，进行传代、计数后可冻存每管细胞10*6-7个/ml 或接种到96孔板、6孔板中进行实验。 细胞计数板 使用前准备：计数板和盖玻片用75%乙醇喷洗后擦干净 25X16细胞计数板 细胞计数 25×16型的计数板 将计数室放大，可见 细胞个数／1mL= 8个体积为 0.1ul的方格的细胞总数/ 8*10-4 ×稀释倍数（稀释倍数常为8，即700 ulPBS+100ul 细胞重悬液） 计数原则：上计下不记，左记右不记。 实验应用 MTT MTT全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT 浓度为5mg/ml:称取MTT 0.5 g，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤除菌分装，-20保存备用(注：保存在包邮锡箔纸的离心管中，配制和使用时关闭操作台灯源) 。 MTT比色法是检测细胞存活和生长的方法（是相对值，且A在0.3~0.7范围内）。 MTT原理 MTT操作步骤 接种细胞：细胞悬液，每孔1000-10000个/200ul胞接种到96孔板，设5个复孔。加100ul培养液在垂直悬空加100ul细胞悬液。 分组给药：分阴性对照组（K）、阳性对照组（E2）、给药组（ 10 -4 ~10 -9）。 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 呈色：培养3-5天后，20ul/孔 5mg/ml MTT溶液。继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪(预热30min) 上测定各孔光吸收值，SPSS分析数据。 * 佳木斯大学 张明磊 细胞计数板 将其置于倒置显微镜下调整视野 100 ul S=1.0mm2 H=0.1mm V=0.1mm3=0.1ul 细胞数/ml=查得细胞数（万）个/ml 取细胞悬液= 所需细胞数 所需细胞数 ×1ml = ×1000ul 查得细胞数 查得细胞数 如：96孔板接种A375细胞，4500个/孔 所需细胞数=4500个/孔×60孔=270000个=27万 查得细胞数=360万 取细胞悬液（ul）=27万/360万×1000=750ul MTT DMSO 酶联免疫检测仪在490nm波长处测光吸收值A (0.3~0.7)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，可间接反映活细胞数量,。