蛋白质的研究方法精要.ppt

主要内容 蛋白质样品的获取——分离纯化 蛋白质的检测和鉴定 蛋白质的结构分析 蛋白质生物功能检测 蛋白质样品的获取——分离纯化 研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 基本原理： 一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。 在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 蛋白质的制备一般分为以下四个阶段： 选择材料和预处理， 细胞的破碎及细胞器的分离， 分离和纯化， 浓缩干燥和保存 一、选择材料和预处理 对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： （1）用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。 另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 3.交替冻融法： 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀 而使细胞胀破。 4.超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。 5.化学法 可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法（三）根据蛋白质带电性质进行分离（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法  （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 . 蛋白质的胶体性质： 蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。 此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的 作用。 若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素 ，蛋白质极易从溶液中析出 1、蛋白质的盐析 一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 盐析法 概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低 常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。 缺点： 易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。  （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1、透析与超滤 　　透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。　　超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。2、凝胶过滤法 　　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。1、电泳法　　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法　　离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维