外膜蛋白T在尿路致病性大肠杆菌致病机理中的作用的初步的研究.pdf

嘲煳 外膜蛋白T在尿路致病性大肠杆菌致病机 理中作用的初步研究 硕士研究生：刘晓露 指导教师：曹虹教授 摘要 一、研究背景和目的 tract 尿路感染(Urinaryinfection，UTIs)是临床上最普遍的细菌感染之一。 女性比男性易感，约有81％的UTIs发生在女性，年龄在16到35岁之间，其中 27％女性在初次尿路感染后半年内复发，48％在一年内复发。其次，UTIs也是老 年人和小儿常见的感染性疾病【l羽。目前尿路感染以抗生素治疗为主。 Escherichia 尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic 占80哆扛_90％。大部分尿路致病菌起源于肠道，并经尿道上行至膀胱，约95％ 的UTIs起始感染部位是膀胱。目前对尿路感染的研究主要围绕UPEC展开的。 UPEC相关毒力因素包括：洳溶血素、细胞毒坏死因子1等毒素；含铁产气杆菌 素；荚膜；脂多糖等和一些粘附器官14-9]。其中UPEC对宿主尿路上皮细胞的粘 附能力是其致病的最重要因素，粘附素的表达常常是致病的关键，其有助于 UPEC黏附尿路从而避免被大量尿液冲刷清除。流行病学分析及临床研究表明： 不同于直肠来源的大肠杆菌，UPEC几乎都是B2型，表达典型的UTIs相关O 抗原，带有许多与尿路致病相关的毒力基因，如：编码FimH黏附素的基因fimH, 编码P菌毛的基因pap，编码S菌毛的基因sfaS，编码溶血素的基因坳，编码 鼠疫菌素受体的基因痧“以及编码大肠杆菌外膜蛋白T的基因ompT等。这些 毒力基因的功能多与粘附、侵袭、血清抗性和代谢等相关，并得到实验证实【¨l。 中文摘要 但有些基因，如ompT，绝大多数UPEC都携带此基因，是假定的UTIs相关毒 力基因，而关于ompT在尿路致病机制中的功能一直未得到实验证实。本课题的 目的在于初步研究基因ompT在UPEC的致病机理中是否起到一定作用。 本研究利用Red同源重组系统构建UPCE CFT073的ompT基因敲除株，命 名为COTD，建立人膀胱上皮细胞株5637体外细胞模型，考察ompT基因的缺 失对致病株黏附及侵袭能力的影响。并且通过红细胞凝集试验观察ompT基因对 I型菌毛的表达是否有影响。同时建立UPEC易感小鼠C57BL／6的UTIs模型， 考察ompT基因的缺失是否对细菌体内侵袭能力产生影响；通过病理切片分析， 观察细菌体内聚集形态的变化。为进一步研究ompT基因敲除导致的致病差异是 否通过OmpT酶活性起作用，需克隆表达OmpT及失去蛋白酶活性的OmpT。 因此本文第三章内容为构建蛋白OmpT及其失去酶活的点突变体的表达纯化及 复性方法，并对两者酶活进行鉴定，观察OmpT体外水解抗菌肽的能力以及对 UPCE的保护作用。 二、研究方法 1、Red同源重组 本方法是利用大肠杆菌九噬菌体的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重 组事件的原理，将两端带有同源重组臂的一段外源DNA序列导入并替换细菌基 因组上同源重组臂序列间的DNA序列，达到目标基因敲除的目的。 第一步构建敲除子。根据NCBI网站上获得的ompT基因序列，选取该基因 开放阅读框上下游50bp片段作为同源重组臂。然后根据卡那抗性基因序列设计 一对扩增引物，分别与同源重组臂组成敲除子引物，命名为OmpT_Kan_F2和 Kan OmpTR2，以pET28a载体为模板，利用PCR技术扩增并纯化敲除子。第 CFT073，以氨苄抗性平板筛选阳性克隆，把敲除子电转化到转化了pKD46的 CFT073中，通过L．阿拉伯糖诱导同源重组的发生，以卡那霉素平板筛选出发生 同源重组的克隆。最后通过正向和反向筛选鉴定敲除体：正向筛选，在5’和3’ H 硕士学位论文 同源重组臂的外侧设计PCR引物。比较用这对引物从卡那霉素抗性克隆和 CFT073扩增出的PCR片段的大小。从未发生正确重组的细菌克隆上，这对引物 扩增产物的长度为1781