鼠疫耶尔森氏菌重pcr-微孔板杂交-eia检测技术的研究.pdfVIP

鼠疫耶尔森氏菌多重PCR_微孔板杂交一EIA检测技术的研究 摘 要 目的：建立鼠疫耶尔森氏菌防污染多重PcR一微孔板杂交一E队检测鉴定技术用 于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测鉴定。 方法：针对分别存在于鼠疫耶尔森氏菌pMTl和pPcPl质粒上的毒力基因∞，=『和 p肠，以及一段276bp染色体序列如分别设计引物，其中上游引物5’一末端生物 素标记，建立多重PcR反应体系。用特别设计的三对引物制备捕获探针并分别包 被聚乙烯微孔板，原则是探针的长度在400一700bp之间，且包含靶序列，以提高 杂交检测效率。待鉴定标本用生物素化的三对检测引物多重PCR扩增，扩增体系 中用uNG防止产物污染。同时检测c哩疗、3d和p肠三个靶序列，相应扩增产物大 小分别为171、276和480bp。扩增产物热变性后在预包被捕获探针的微孔板中严 格条件下分别杂交和漂洗。信号检测系统采用链霉亲和素化的辣根过氧化物酶， 以TMB作为底物，显色反应结束后，2M Micr04酶 H2S04中止反应，在Hypcrion 标仪上读取OD450．阳阴oD比值丑．1为阳性。 结果：应用该鉴定技术对我国鼠疫耶尔森氏菌17个生态型及新发现的青藏高原青 海田鼠疫源地菌株的检测结果表明，多重PCR-电泳法检测结果．54株实验菌株均 扩增出预期的3条产物带，相关菌株均阴性，检测灵敏度为loof妒NA；多重PcR一 微孔板杂交检测结果，20株实验菌株全部阳性(OD450O．151一o．967)，相关菌株均 阴性(OD450 0．007一O．019)。其检测灵敏度为10琅DNA。 结论：该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和敏感 性，多重PCR．微孔板杂交检测的敏感性较多重PCR-电泳法检测的敏感性高10倍； 所研制的防污染多重PcR一微孔板杂交一ELA试剂壳服了目前PcR试剂运输不 便，产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点，为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴 定提供了有力手段。 关键词：鼠疫耶尔森氏菌；鉴定；多重PCR；微孔板杂交；防污染 Anti-contamination hybridiza咖n—七nzyme multiplexPCR—蚰icropIate for imm佃oassay(EIA)identi母illg，础缸p积妇 Abstract establishanAm卜con诅mlmtlon dizatlon objective：+110 multlplexPcR衄cmplatehybn immuIloassay(EIA)forid∞tifying坛坶fnm enZyme p船出．Methods：111especinc were b嬲edon on primersdesigned vimlem-related窘ene∞归andp胁located pMTl a11d 肌d aZ marker扣 onthe pPCPlrespectiVely p部打s—specmcsequences c11ronlosomeThree aS PCR wereused to designed specincally products c印tureprobes coaton microwell