一种基于同源重组教案.ppt

* Southwest University 报告人：张兴国 一种基于同源重组构建 多基因双元载体的方法 . 转基因作物：已形成产业， 具较高商业价值和竞争优势 发展方向 多基因转化 多性状改良 数量性状改良 目前主要以单基因或寡基因转化为主。 . 多 基因 转化 方法 连续再转化法 转基因植物杂交聚合法 多载体共转化法 多基因载体 转化法 多聚蛋白 酶解法 独立 表达盒 法 依赖归巢酶的pRCS/pAUX和 pSAT载体系统 Cre/loxP位点特异重组系统 MultiSite Gateway MultiRound Gateway Multiple-round in vivo site-specific assembly (常规的)酶连重组法 BiBAC/TAC大分子量DNA转化法 . 独立表达盒的多基因载体转化法 5-10个基因 载体过大时，DNA操作难度大 (终会)无适当的限制性酶切位点 ColE1复制子难承担大载体DNA的复制 (常规的)酶连重组法 存在的问题 重组基因数量有限 . BiBAC系统（Hamilton等，1996 ） TAC（Liu YG 等1999） 大分子量DNA转化法 问题 文库构建和筛选繁琐、工作量大 转化天然大片段DNA， 不能将单基因重组成多基因载体 目的性不强、易引入无用或不利基 因、带来遗传冗余 解决了大分子量载体DNA在E.coli的复制 . Multiple-round in vivo site-specific assembly(MISSA) （Chen Qi-Jun等2010） 解决了(常规的)酶连重组法的所有问题 P1 ori 或 F ori. Cre/Loxp、int/aat位点特异性重组系统. E.coli中构建多基因双元载体。 pRiA4 ori 问题？ 多重同源重组法(MultiRound Homologous Recombination). pCAMBIA1302 E.coli T T 农杆菌 pBR322 Z CΔ AmpR CΔ pBIN19 AmpR ColE1 Kan 受体载体 供体载体 C B A CΔ AmpR E MAR D E MAR D AmpR C B A A B C AmpR D MAR E E MAR D AmpR CΔ 无农杆菌复制子 农 . 农杆菌 E MAR AmpR C B A D STA Rep EΔ AmpR E MAR D AmpR CΔ H G F TcR nptII EΔ E.coli pBR322 pBIN19 Z F G H 农杆菌 STA Rep E MAR C B A D H G F TcR nptII H G F TcR nptII EΔ E.coli中克隆(酶连重组的)1-5个基因，构成供体载体。 主要特点 农杆菌中通过同源重组延伸T-DNA 利用农杆菌复制子承担大载体DNA的复制 可将大量单基因重组进T-DNA， 构成大分子量和含多基因的T-DNA。 1.供体双元载体构建 同源重组系统的建立 PsSYM10 Pro Ter PsLEC Pro PsENOD12A pVCT2121 13772bp PsSYM35 Pro PsSYM10 Pro Ter PsLECTIN Pro Ter PsENOD12a Pro RB LB STA REP Kan ColE1 T35s Tnos nptIIΔ . 2.Amp/Carb 抗性的供体载体构建 T35s PsSYM35 Pro Amp pVC