第二章植物细胞工程.解读.pptVIP

第三节 植物原生质体技术及应用 一、原生质体分离方法及原理 二、分离原生质体的操作程序 三、原生质体培养 四、原生质体融合 五、原生质体的遗传饰变 一、原生质体分离 分离方法：机械法 酶法 果胶 纤维素和半纤维素 酶法的原理： 降解果胶，使细胞分离 降解纤维素或半纤维素去除细胞壁，使裸露的原生质体游离出来 细胞壁的主要成分：纤维素和半纤维素 细胞间由果胶物质黏连在一起 酶的种类： 纤维素酶类（Cellulase）：Onozuka R-10 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 酶液的准备 渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇等糖醇 pH值调节至5.6左右 用0.45μm的细菌过滤器进行除菌处理，冷冻保存 二、分离原生质体的操作程序 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 取材 消毒 处理 分离纯化 植物材料的消毒和处理：叶片、茎段、花瓣等 水洗 消毒 无菌水冲洗 2. 酶液处理：材料与酶液按1：10的比例； 处理温度：25-28 ℃； 黑暗或弱光照； 低速摇动（35-40r/min); 处理时间：通常 3-18h 二、分离原生质体的操作程序 3.原生质体的收集与纯化 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步：原生质体溶液用40-80μm尼龙网筛过滤。 第二步：离心（600-1000r/min，离心3-5min）。 第三步：吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 界面法：1973年Kanai和Edwards创立 选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。 界面法进行原生质体纯化 碎片带 原生质体带 0.45mol/l 蔗糖 0.45mol/l 蔗糖 酶解产物+原生质体培养基（ 0.45mol/l甘露醇） 400g, 离心5min 纯度高 活力高 4.原生质体计数及活力检测 计数：原生质体经分离和纯化后，需要进行活力测定和计数。原生质体培养时有一种密度效应，一般104-5个/mL有利于培养。计数可用血球计数板进行（个/ml) 活力测定： 1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 0.1%酚番红：活的原生质体能吸收而呈红色，死的则无此能力； Evans蓝染色：有活力的不被染色，死原生质体可吸收被染上色。 双醋酸酯荧光素(FDA)染色法：FDA本身没有荧光和极性，可自由渗透进出完整质膜。活的原生质体的酯酶能分解FDA成为具有荧光的极性物质，无活力的不产生荧光。 活力测定： 第二章 植物细胞工程 细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学原理，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究和改造生物遗传特性和其他生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的技术。 本章的主要内容 第一节 植物细胞培养 第二节 植物细胞培养的应用 第三节 植物原生质体技术及应用 第一 节 植物细胞培养 植物细胞培养（plant cell culture）：指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植物的技术。 植物细胞培养的意义： （1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； （2）用于植物品种的改良； （3）用于植物次生代谢物质的生产。 单细胞培养 细胞的悬浮培养 培养类型 一、单细胞培养（通常以叶片为材料） （一）单细胞的分离 分离方法：机械法和酶解法。 机械捣碎法 将外植体捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。 优点：不用酶，细胞不会受到伤害；没有经过质壁分离，利于生理生化研究。 缺点：机械作用，细胞结构破坏大，得率低。 最佳材料：叶片 方法及步骤： 第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：先把叶片轻轻研碎，然后通过 过滤和离心净化细胞。 叶片表面灭菌→切成小于1cm2的小块→玻璃匀浆管中匀浆→过滤（孔径分别为：61?m和38?m）→低速离心，弃上清→悬浮细胞→细胞培养 酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞；该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。 首次成功：烟草叶细胞 步骤：叶片表面灭菌→撕去下表皮→切成4cm2小块→放入酶液中→抽真空→摇床上酶解→每30mi