分子诊断技术之PCR资料.ppt

温度与时间的设置 退火温度与时间 经验公式：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 温度与时间的设置 延伸温度与时间 循环次数的设置 决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 四 PCR诊断技术流程 病料总DNA的分离 病料总DNA的电泳检测 配制PCR扩增体系 设置PCR循环参数 进行PCR扩增 PCR产物的电泳检测 病毒感染结果判断 质量高 质量差 有带 无带 阳性 阴性 DNA病毒诊断 RNA病毒诊断 五 PCR诊断技术流程 病料总RNA的分离 病料总RNA的电泳检测 配制PCR扩增体系 质量高 质量差 配制反转录反应体系 反转录合成cDNA 设置PCR循环参数 进行PCR扩增 PCR产物的电泳检测 病毒感染结果判断 有带 无带 阳性 阴性 实验一：耗材的准备及试剂的配制（全班分4大组） 实验耗材： 实验试剂： NaCl: 3M 50ml/班 Tris: 1M(pH8.0) 50ml/班 EDTA: 0.5M(pH8.0) 50ml/班 NaAc: 3M(pH5.2) 50ml/班 CTAB抽提液（未加β-ME）: 20ml/组 匀浆缓冲液： 20ml/组 消化缓冲液： 20ml/组 TE 缓冲液： 8ml/组 SDS: 10% 8ml/组 Tris平衡酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）： 50ml/组 氯仿：异戊醇(24:1): 50ml/组 75%乙醇： 50ml/组 无水乙醇： 30ml/组 试剂标签：名称、浓度、pH、班级、组别、日期。 移液器吸头：1ml 4盒/班 200ul 4盒/班 10ul 4盒/班 离心管： 1.5ml 4烧杯（200ml）/班 　CTAB法主要试剂 植物性材料DNA的分离提纯 ---CTAB法 CTAB抽提液： 3%（W/V) CTAB 1.4M NaCl 100mM Tris pH8.0 20mM EDTA pH8.0 2%(V/V) β-巯基乙醇(用前加入) 5%(W/V) PVP40(可以不用) TE缓冲液： 10mM Tris pH8.0 1mM EDTA pH8.0 其他试剂： Tris平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 氯仿：异戊醇=24:1 RNase 储存液：10mg/ml NaAc (pH5.2)： 3M 无水乙醇 1 样品处理： 取植物叶片5～10g，剪碎，加入6ml 65℃预热的CTAB抽提液，置于组织研磨器中进行研磨，形成匀浆液，分装1.5ml离心管，每管600ul，置65℃水浴锅中水浴裂解30-60min； 或者 取植物叶片5～10g，剪碎，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，轻轻研磨至粉末（注意不要使粉末解冻，其间可反复添加液氮），将粉末转入1.5ml离心管，加入600ul 65℃预热的CTAB抽提液，置65℃水浴锅中水浴裂解30-60mi