第三章细胞培养的基本方法资料.pptVIP

第三章 细胞培养的基  本方法 第一节 无菌操作技术 第二节 培养细胞的观察 第三节 细胞培养中常用的染色方法 第四节 细胞培养的污染和检测 教学目的和要求 重点和难点： 掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题； 预防污染是无菌操作的关键。 第一节 无菌操作技术 由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。一切操作需要保证无菌和有条不紊。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。 培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干； 用合适的方法灭菌。 （二）无菌操作室 工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌30分钟，超净工作台酒精（75%）杀菌，工作中一直吹风。 三、洗手和着装 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 4、超净工作台上的器具和用品要摆放合理； 5、操作时器具不能触及瓶口以防止污染； 6、不要说话、咳嗽、打喷嚏等，头发、首饰等注意； 7、吸管、注射器等专管专用。 五、使用超净台注意事项 1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命； 2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理； 3、使用前用75％酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作； 4、净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰； 5、用后工作台要用75％酒精擦洗，以备后面工作人员使用； 6、经常注意工作区上方微压表的指示，及时更换滤器。 六、 培养细胞的取材 取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。 取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。 原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。 欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。 常用方法有机械法和化学法。 第二节 培养细胞的观察 组织块培养法 将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。 培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。 如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。 换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡 消化培养法 采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。 密度抑制（Density inhibition）或接触抑制（Ccontact inhibition） 1958年Abercrombie 等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。 所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。 培养细胞的生长过程 1） 原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。 2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。 一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis） 有些细胞的少数后代，或通过人工