《细胞与免疫学技术与原理》课件解析.ppt

2、悬浮型 有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。 细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。 二、培养细胞的生长和 增殖过程 细胞在体外培养后，在一切条件适宜的情况下，最主要的活动是生长和增殖。 细胞生长：细胞体积增大。 细胞增殖：细胞数量增多。 1、培养细胞的生命周期 组织培养细胞生命周期指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。 进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段： 原代培养期 传代期 衰退期 2、培养细胞的一代生存期 细胞“一代” 仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增一代不同；细胞世代是指细胞的生命周期。而在细胞的一代中，细胞能倍增5～6次。 细胞传一代，一般要经过以下三个阶段： 潜伏期 指数增长期 停滞期 培养细胞的生长曲线 3、细胞周期 一个细胞周期是从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，这种细胞物质积累和细胞分裂的循环过程，称为细胞周期。 细胞周期分为细胞间期和细胞分裂期两个阶段。 4. 细胞系的生长过程 细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物种族及年龄。不同的细胞体外培养可传代数不同，当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。 人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间。 恒河猴的皮肤成纤维细胞能传40代；鸡胚胎成纤维细胞最多能传30代；小鼠成纤维细胞只能传8代左右；如供体为成体或衰老个体，则生存时间更短；如培养的肝细胞或肾细胞，仅能传几代或几十代。 体外培养条件可能延迟细胞衰老，寿命从50代延至150代。当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。 第三章培养细胞性状的检测与保存 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液的pH是否变酸、变黄是否需要更换等。 一、细胞常规检查观察的内容 1、肉眼观察 2、显微镜观察 3、离体活细胞染色观察 (1)中性红染色 (2)结晶紫染色 (3)台盼蓝染色 2、消化细胞培养法 单层培养的表皮细胞 单层细胞培养示意图 胰蛋白酶冷消化法 胰蛋白酶热消化法 消化得到的细胞沉淀，用培养液配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水平放置，37℃进行培养，每隔1～2天换培养液一次，培养一定的时间后，细胞在瓶底可长成一单层。 单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右） 单层细胞培养的好处： （1）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞从培养液摄取营养和排除代谢产物； （2）易于观察某些因子加到培养液内后的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响。 （3）当细胞粘附在基底质上后，则更容易表达某些产物； （4）单层细胞培养更适用许多细胞系。 （5）适合大量细胞培养。 第二节动物细胞传代培养 原代培养过程中要不断更换新鲜培养液以维持细胞的生长。待细胞生长到一定的限度时会产生接触抑制，需要对细胞进行再培养。 概念：由原代培养的细胞经消化分离后，从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为细胞传代培养或再培养。 传代培养形成的细胞群称细胞系。细胞系虽然比原代培养物的细胞组成均一得多了，但它仍不是单一细胞。必须在细胞系的基础上进行单细胞的克隆化、筛选而形成细胞株。 一、需要更换新鲜培养液的提示 1、培养液的pH值下降 2、细胞浓度 3、细胞类型 4、细胞形态学 二、传代培养的确定 1．细胞生长停滞，继而细胞出现脂肪滴、衰老或者组织块脱离基质漂流在培养液中。 2．正常细胞生长贴满瓶壁后，由于正常细胞表面具有接触抑制，因而细胞生长受抑制。 3. 肿瘤细胞生长可形成多层细胞。多层细胞中，在低层部位的细胞与培养液不能直接触，结果由于营养不足而生长停滞，甚至细胞呈片状脱离瓶底而漂浮在培养中。 三、传代培养的方法 1、单层细胞的传代培养 （1）轻