核酸要点分析.ppt

RNA的一级结构 　RNA分子中各核苷之间的连接方式（3′-5′磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构. 线性结构，部分区域是双螺旋． 核糖 碱基:A U C G 稀有碱基(tRNA) 5’帽子结构功能 可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。 3’polyA结构功能 真核生物的mRNA与原核生物的mRNA的区别 从分子结构上来看，真核生物和原核生物的mRNA是完全一样的，都是核糖核酸，由四种核糖核苷酸组成，并且都是由基因转录而来。但两者有很多区别，如下：（1）原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。 （2）原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。（3）原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟。真核生物mRNA的半寿期较长，有的可达数日。（4）原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。真核生物mRNA由5′端帽子结构、5′端不翻译区、翻译区、3′端不翻译区和3′端聚腺苷酸尾巴组成，原核生物mRNA无5′端帽子结构和3′端聚腺苷酸尾巴。 1 酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。 2 碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感。 DNA抗碱水解。 生物学意义： DNA更稳定，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 3 酶水解 （1）非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 （2）特异的磷酸二酯酶 核酸酶 （3）N-糖苷酶 核苷酸的解离曲线 * 二、核酸是两性化合物 （一）碱基可发生互变异构 （二）碱基在体液环境中以碱性解离为主 核酸的两性性质及等电点 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 （三）核酸分子是酸性化合物 pK1? = 0.9 第一磷酸基 pK3? = 6.2 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 腺嘌呤核苷酸 pK1? = 0.7 第一磷酸基 pK3? = 6.1 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 烯醇式羟基 鸟嘌呤核苷酸 pK1? = 0.8 第一磷酸基 pK3? = 6.3 第二磷酸基 pK2? = 4.3 含氮环 胞嘧啶核苷酸 pK1? = 1.0 第一磷酸基 pK3? = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基 尿嘧啶核苷酸 离子化程度 pI=(pK1? + pK2? )/2 三、核酸溶液有高分子性质 粘度 ： DNA 〉RNA dsDNA 〉ssDNA 沉降系数： 溶液中的核酸在离心力场中可下沉。DNA分子经反复盘曲形成超螺旋后，其沉降系数增加，超螺旋松解后其沉降系数减小。 四、核酸有紫外线吸收的特性 核酸的紫外吸收（OD260） 单核苷酸 〉ssDNA（或RNA） 〉dsDNA 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2. 判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 OD260的应用 五、核酸具有变性、复性和杂交行为 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 （一）核酸变性时空间构象破坏 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260(absorbance, A, A260代表溶液在260nm处的吸光率)值作图，所得的曲线称为解链曲线。 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。