宏基因组要点分析.pptVIP

参与人员：黄雨欣、梁龙锋、王江飞、张伟苗、余中华 产生背景 人类基因组计划(human genome project，HGP)的完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为主的后基因组时代 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。 要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究 什么是宏基因组 “1998年Handelsman等首次提出宏基因组的概念。一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系、及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。 宏基因组(the genomes of the total micro biota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。 宏基因组的研究步骤 从环境中提取生物DNA； 用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上； 转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库； 宏基因组文库筛选。 从环境中提取生物DNA 提取步骤通常需要满足两个条件： ①尽可能提取样品所有微生物的基因， ②保持片段的完整和纯度。 目前所开发的DNA提取方法有两种： 直接裂解法和间接提取法 直接裂解法 操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等 提取方法差别：细胞破壁的方式不同 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好 缺点：但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1—50 kb) )且多为平端，不利于建库，同时难以完全去除酚类物质 间接提取法 操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比直接裂解法少10—100倍 载体的选择 一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大，则无法完整克隆。 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。 宿主的选择 宏基因文库构建绝大多数采用cosmid、BAC或fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细菌, 因而构建广宿主或穿梭宏基因组文库在充分挖掘和筛选功能新基因的研究中尤为重要。 宏基因组文库的建立 宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。 基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株 直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插入的宏基因片段一般小于10 kb 宏基因组文库的筛选 筛选技术大致可分为四类： ①基于核酸序列差异分析； ②基于目的克隆功能的特殊代谢活性； ③基于底物诱导基因的表达； ④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。 基于序列的筛选方法 根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因 对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序 。 优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。 基于功能的筛选方法 功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆 不需要已知