分子生物学实验5资料.ppt

琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 1.柱回收试剂盒 是目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 2.低熔点琼脂糖 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法现在用的人已经不多了。 以前经费紧张，低熔点琼脂糖贵，比较经济方法就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再切出来，这样就非常节约了。 二、实验目的 1. 从含有目的基因片段凝胶块上回收DNA。 2.回收目的基因片段为下步连接反应作准备 仪器及耗材：天平、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管。 材 料： 含有目的基因酶切产物的凝胶块 试 剂： AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 ；无水乙醇； 三、实验仪器、材料和试剂 四、实验步骤 1. 凝胶称重（提前记录 1.5 ml 离心管重量），按照1：3加入 BufferDE-A（如 100 mg凝胶加入300 μl DE-A Buffer,100mg=300ul）。 2. 于 75oC加热，间断混合（每 2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min）。 3. 融化后，加0.5个bufferDE-A体积的bufferDE-B，混合均匀。 4. 将回收柱放置于收集管上，溶解的凝胶加入到回收柱中，12 000 g, 室温离心1 min; 5.将回收柱重新放置于2 ml收集管，加500 μl W1 Buffer, 12,000×g 离心0.5 min，弃滤液。 6. 重复步骤5一次； 7.将回收柱重新放置于2 ml收集管，加700 μl W2Buffer, 12,000×g 离心0.5 min，弃滤液。 8. 重复步骤7一次； 9．将回收柱放回收集管，12 000 g离心1 min. 10．将回收柱置于洁净的 1.5 ml 离心管中，在回收柱结合DNA的膜中央加 25-30 μl Elution Buffer 或去离子水，室温静置 1 min。12,000×g离心 1 min 洗脱 DNA。 胶回收试剂盒操作步骤（omega） 1. 配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。 我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液。不要重复使用电泳缓冲液，旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量； 2. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA的片段切下来。并尽量去除多余的凝胶。 注意：DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒，同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜。 3. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1g／ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次； 重要提醒：在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。观察混合物的颜色，如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。一般情况下，使用新鲜的电泳缓冲液，凝胶－Binding buffer混合物的PH值的不会升高； 4. 转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干凈的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去液体。 一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μl的溶液，如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl，可先转移700μl溶液至柱子，离心完后，将余下的溶液继续加上柱子上。但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μg DNA。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱中。 5. 将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室温下，10,000×g离心 1分钟，去弃滤出液