ChapterDNAmanipulation-资料.ppt

四、亚克隆操作过程 酶切（限制性内切酶） DNA片段的分离和纯化 连接（新载体） 转化 筛选 重组DNA的分析 （一）连接反应 1、连接反应类型： 相同粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 一平一粘的连接 平端连接 2、定向克隆： 不同粘性末端的连接 一平一粘的连接 片段末端 克隆的要求 说 明 平端 高浓度的DNA和连接酶 非重组体克隆的背景可能很高； 接合处的限制性酶切位点消失； 重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝 不同的突出端 消化后需 纯化载体以 提高连接效率 非重组体克隆的背景较低 ； 接合处的限制性酶切位点可保留； 外源DNA只以一个方向插入到重组质粒 相同的突出端 常用 碱性磷酸酶处理 外源DNA以两个方向插入 ； 接合处的限制性酶切位点可保留 ； 重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝 -P -OH -OH -P 3、连接的操作： 消化 digestion 单酶消化 / 双酶消化 连接 ligation 自身环化 self-ligation 碱性磷酸酶 alkaline phosphatase 目的DNA+载体 4、DNA连接酶（DNA ligase）/ 辅助因子 T4 DNA连接酶（平头和粘头）/ATP E.coli DNA连接酶 （粘头）/NAD+ 5、连接效率 efficiency 载体：目的DNA = 1:3~1:7（摩尔比） 6、连接方向：正向 / 反向（与启动子的方向是否相同） plasmid ampR ori E H E E H E E X S S A B H E E H E E X S H C E H S E X D H E E X E X S H E （二）转化 transformation （三）转化子的筛选 selecting / screening （四）转化子的鉴定： 酶切鉴定：插入片段的大小和方向 E X S H E H E E X A B C E H S E X D 4000 2000 700 6000 A H E S/H S B S/H H H E H E/H C D 第三节 转基因操作 一、转基因植物 1、农杆菌介导的方法（Ti质粒、T-DNA） 2、基因枪法 二、转基因动物 动物转基因操作： 1、显微注射（使用最广泛） 2、胚胎干细胞（ES细胞） 电穿孔法 磷酸钙转染 脂质体转染 显微注射获得转基因超级鼠 显微注射示意图 三、转基因检测 PCR Southern-blot 检测DNA Northern-blot 检测RNA Western-blot 检测蛋白质 性状观察 Question 1、叙述PCR的反应体系及反应的基本步骤 2、PCR和细胞内DNA复制两者有哪些主要的相同点和不同点? 3、试述转基因植物检测的手段 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 引物与靶序列退火 * 在凝胶上的位置与链的碱基的位次相对应 测序胶：变性PAGE凝胶 （+尿素） * 硫酸二甲酯：Ｇ 甲酸Ａ＋Ｇ 阱：Ｃ＋Ｔ 阱，高盐：Ｃ * 目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个 * 毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。 * 在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可