氨基酸-王镜岩生物化学(全)资料.ppt

人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * (一) 原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： 溶质斑点中心的移动距离 溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。 Rf值 = R f值（相对迁移率） 影响Rf值的因素有很多,除被分离组分的化学结构、样品和溶剂的pH值、层析中温度等外,流动相(展开剂)的极性也是一个重要因素。 展开剂极性大,则极性大的物质有较大Rf值,极性小的物质Rf值亦小,反之亦然 常用流动相的极性大小依次排列如下: 水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯氯仿乙醚甲苯苯四氯化碳环己烷石油醚 层析时,流动相不应吸取滤纸中的水分,否则改变分配平衡,影响Rf值 所以多数采用水饱和的有机溶剂如水饱和的正丁醇,被分离物质的不同,选择的流动相也不同 （二）、层析的步骤： 1、层析介质的选择 2、点样 3、展层 4、检出和鉴定 纸层析是分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定， 将氨基酸混合物点在滤纸的一个角上，称原点。然后在密闭的容器中用一个溶剂系统(如丁醇—乙酸)沿滤纸的一个方向进行展层。烘干滤纸后，旋转90。，再用另一个溶剂系统(如苯酚—甲酚—水)进行第二向层层。由于各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。当用茚三酮溶液显色时，得到一个双向纸层析谱 (图3—25)。 B、薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。 如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析； 如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析； 同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析； 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15—30min，分辨力比纸层析高10～100倍，它既能分离0．01ug的微量样品，又能分离500mg甚至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。 A、定义：是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对溶液中各种离子的结和力不同而达到分离目的的一种层析分离技术。 2. 离子交换层析 1 2 3 4 5 原始缓冲溶液的反离子 样品溶液 梯度浓度 1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品与反离子进行交换 3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质 5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用 B、离子交换剂 母体：不溶性高分子。如纤维素、凝胶、树脂。琼脂糖、葡聚糖等 可解离基团： 酸性基团： -SO3H（SE强酸型）、–COOH（CM弱酸型）也称阳离子交换剂 碱性基团： -NH2 （AE，弱碱型）， -N（CH3 ）2 （DEAE）， -N+（CH3）3（强碱型）、也称阴离子交换剂 阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。如磺酸基(一S03H)，磷酸基(一P03H)，亚磷酸基(一PO2H)，羧基(一COOH)，酚羟基(一OH)等。 引入酸性基团的交换剂可离解出H+，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。 根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基或酚基)三种。 R—