重组质粒构建资料.ppt

一般外源片段较载体摩尔浓度高 ，5：1。有的加入聚乙二醇。可使反应速度加快。 连接反应： H2O 补充使总体10ul ATP（含在buffer 中） 10XBuffer 1ul 外源DNA 1ul 载体DNA 3-4ul T4DNA连接酶 1ul 　 　 　 外源基因与载体的连接 粘性末端连接 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 由于操作简便，质粒最为常用。 * 严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。 TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。? * 消耗能量 长转录导致不正确的二级结构，降低翻译效率。 * 丝状噬菌体F1 * * * * 总的来说连接反应时的温度不宜过高，否则片段末端容易松脱不易连接（分子热运动随温度升高而加剧），但又不能太低否则连接酶活性太低。 * * * 同尾酶 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。 如XbaⅠ(T`CTAGA)、Nhe Ⅰ(G`CTAGC） 、Spe Ⅰ (A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即 Bfa Ⅰ（C`TAG) 的酶切位点。 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 同裂酶 限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。 星号活性的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。因此, 尽量采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。 星号活力 克隆（有时与甲基化酶联用） 鉴定（基因片断大小、正反向） 检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性RFLP） 制作Marker 限制性内切酶的应用 限制性内切酶的使用 一个标准的酶切反应包含： DNA 合适的酶缓冲液 蛋白酶 为了提高酶切效率，可加入BSA。 1、建立一个标准的酶切反应 通常，10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。 应用中的注意点 2. 选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接 3、加酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的