用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产资料.ppt

* * 张星元：发酵原理（讲座） * 然而分子水平的实验证实，即便是在这种情况下，这种简单的方法仍不能导致赖氨酸的高效合成。显然，通过随机诱变和筛选所得到的高产菌株，其代谢网络已发生了许多改变。从很多例子都可推断，单单改变某一 “ 重要的 ” 步骤（“瓶颈”）并不一定能实现氨基酸的过量合成。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 因为对于长而复杂的代谢途径而言，绝对的单个限速步骤几乎是不存在的。换言之，整条途径在代谢网络范围内已经是调整好了的，“分摊式的代谢调控”（整条途径上的代谢调控实际上是由许多个步骤共同分担）的发现也说明了这个问题。这对于有目的的代谢设计是有重要意义的。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 仅仅提高合成途径的流量往往并不足以将代谢流导向特定氨基酸，实现特定氨基酸的过量合成。为了增加氨基酸的生产，增加关键前体物的供应量也是十分重要的。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 关键前体物的供应 可通过中间代谢的反应 （如 TCA 环的回补反应支持 TCA 环中间产物的供应、EMP 途径和 HMP 途径分别为芳香族氨基酸的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和4 - 磷酸赤藓糖 ） ， 或者在培养基中额外添加特定前体物供微生物细胞吸收和利用。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 当对合成途径进行修饰或导向时，中心代谢途径的反应出乎意料地成了限制因素；这一点再次强调了细胞代谢通常已得到有效的调节，这也就意味着许多不同反应之间的最佳平衡和秩序井然的分摊式控制覆盖了代谢网络的大部分。只有当合理延伸的代谢网络片段以一种协调的方式得到有目的的改变时，代谢流大规模的导向才能最终导致最优的结果。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 总体来说，副产物的形成可以通过两种策略来避免： * 张星元：发酵原理（讲座） * 最有利的方法是充分地调动所研究的途径，这样就不会形成大量通往副产物的中间产物了；另一种方法是使从目的氨基酸的合成途径分出通往副产物合成的分支的第一个酶失活。前文所述的在生产色氨酸的大肠杆菌菌株中，去除色氨酸酶，就是这一策略的一个成功应用；这样就堵死了色氨酸过量合成条件下色氨酸的主要消耗。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 当引入新的途径或者改变已建立的代谢途径上代谢流的流向时，除了要考虑碳架流，还考虑氧化还原平衡和代谢能平衡。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 对氨基酸产生菌的代谢途径的大规模导向会出现一些问题。实际上，一般氨基酸的分泌，特别是谷氨酸棒杆菌中谷氨酸的分泌被解释为氧化还原作用失去平衡的结果，谷氨酸的分泌在供氧条件的试验过程中，观察到一个明显最佳状态。  * 张星元：发酵原理（讲座） * 在谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸或谷氨酸的条件下，不仅碳架流会发生较大的变化，糖酵解途径（产生NADH）和磷酸戊糖途径（产生 NADPH）间的流量分配也必定会发生巨大的变化。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 此外，从理论上推测谷氨酸棒杆菌赖氨酸最大产量的获得在很大程度上依赖于细胞的 NADPH 的水平。然而，曾尝试过确定赖氨酸生产条件下 NADPH 的真实化学计量，并尝试将其同其他合成反应进行比较，结果惊奇地发现 NADPH 是大大过量的，这一点至今还无法解释。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 这些结果再次强调还原力定量分析的重要性，其对于氨基酸生产菌株总体流量的进一步优化，也具有潜在的重要性。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 关于代谢能平衡的量化问题，就目前而言，几乎还是空白。在氨基酸生产方面，因为关于还原力平衡的问题已有一些讨论，能量平衡问题就常常被忽略。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 除了 ATP 的形成过程和已知的ATP消耗过程之间的不平衡，氨基酸过量合成显然远非仅仅与能量的输入和输出的“偶联”或“赢利”。如上所述，代谢能的重大消耗一般都能观察到，这种损耗一方面甚至会限制产物对基质的转化率，另一方面也可能是增加特定产物分泌的基础。 * 张星元：发酵原理（讲座） * 氨基酸的过量生产可由两种不同的代谢状态引起。诸如赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸及芳香族氨基酸等可通过解除合成途径的调节来实现过量分泌；而谷氨酸的分泌在许多细菌中则是对