2010色谱法及其在生化中的应用1资料分析.pptVIP

第六章色谱法及其在生化分析中的应用 色谱是一种物理或物理化学分离方法. 分离原理： 混合物中各组分在两相间（固定相，流动相）进行分配,各组分的结构和性质存在差异，分配行为就会有不同，从而具有不同的比移值(保留时间). 按分离机制分为： 吸附色谱，分配色谱，空间排阻色谱，离子交换色谱，亲和色谱。 按操作形式分类: 纸色谱,薄层色谱,柱色谱. 第一节 纸色谱 以纸为载体,纸上所含水分或其他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色谱. 一 、基本原理 利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同进行分离. 分配系数和比移值. 二、 纸色谱的影响因素 1、滤纸的影响 2、展开剂的影响 3、物质极性的影响 4、 pH的影响 5、 温度和时间的影响 标准操作规程 滤纸长约25cm，宽度则按需要而定 点样基线距底边约2.5cm 点样直径为2—4mm 点间距离约为1.5—2.0cm 使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm 三 应用: 分离氨基酸, 单糖 双向上行纸色谱法分离混合氨基酸 展开: 第一向为碱系统：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13：3：3 第二向为酸系统：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 显色: 显色用15—20ml 0.5％茚三酮溶液向层析纸的一面均匀喷雾，待自然干燥后，置65℃烘箱烘15min， 定性鉴定与定量测定 发酵液L-亮氨酸的定量测定 简便,快捷,实用. 不同测定方法准确度比较 第二节 薄层色谱 概念: 将细粉状的吸附剂或载体涂布于玻璃板等物,形成均一的薄膜.点样后用展开剂展开,用合适的方法观察样品点的方法. 一、吸附剂的选择 （1）硅胶 （2）氧化铝 （3）纤维素 （1）样品组分的性质 （2）吸附剂的性质： ①根据薄层色谱的分离机制，选择适宜活性的吸附剂。 ②吸附剂对样品的作用 ③薄层的显色方法不同，所用的吸附剂也不同。 ④吸附剂的规格 选择吸附剂的原则 二、展开剂的选择 1.对展开剂的要求 (1)能够溶解待测组分； (2)能使待测组分与杂质分开； (3)使待测组分的Rf值在0.2-0.8之间； (4)不能与待测组分或吸附剂发生化学反应； (5)具有适中的沸点和比较小的粘度； (6)展开后组分的斑点圆且集中； (7)混合溶剂最好临用前新鲜配制。 2.展开剂的极性 单一溶剂的极性顺序是：己烷二硫化碳苯四氯化碳二氯化碳乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水。 四 薄层色谱法常见的问题和消除的方法 (一)斑点拖尾现象 (二)边缘效应 (三)S形及波浪形斑点 (四)斑点呈念珠状 (五)展速慢 (六) Rf值不稳定 标准操作方法 临用前一般应在110℃活化30分钟 点样基线距底边2.0cm(高效薄层板一般为0.8-1.0cm)， 点样直径为2-4mm(高效薄层板一般不大于2mm)， 点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1.0—2.0cm(高效薄层板一般不少于0.5cm)。 点样时必须注意勿损伤薄层板表面。 饱和一般保持15—30分钟， 浸入展开剂的深度为距原点0.5-l.0cm(切勿将样点浸入展开剂中)， 展开距离一般为10-15cm 系统适用性试验 检测灵敏度 比移值(及f) 分离效能 五、应用实例 氨基酸分析: 用薄层色谱法分离氦基酸混合物 穿山甲与3种代用品的薄层色谱及氨基酸定性定量分析 多糖分析中的应用 苦豆子胶多糖：组分薄层色谱分析