分离工程第三章课件.pptVIP

第三章 第一节 沉 淀 通过本章学习应掌握以下内容 什么是沉析？ 沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 沉析的一般操作步骤是什么？ 何谓盐析？其原理是什么？ 盐析操作时常用的盐是什么？ 影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉析法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉析的工作原理是什么？ 其它常用的沉析方法有哪些？ 沉淀（Precipitation）：是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。 结晶：由溶解度降低引起的固体成相现象。 沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产物，相当于重结晶，沉淀分级目前主要用于蛋白质的分离。 常用沉淀方法的分类 一、盐 析 沉 淀 （一）、原理 盐析（Salting-out ）：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 Cohn经验方程： β和Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： 无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； （二）、影响因素 1、蛋白质的分子量和立体结构 分子量越大越易盐析，结构越不对称越易盐析。 2、对特定的蛋白质 （1）无机盐种类（影响Ks) 离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果较好。 选择盐析盐时还应考虑： a、溶解度大。 b、溶解度受温度影响较小； c、盐溶液密度不高，利于沉淀的沉降或离心分离。 d、 常用的盐析盐是(NH4)2SO4，此外还有Na2SO4和NaCl。 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁 (三)、盐析操作(以硫酸铵为例) 确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实验步骤（设操作温度为0℃）： 取部分料液，分成等体积的几份，冷却至0℃； 用下式计算饱和度（浓度相当于饱和浓度的百分数）达到20％~100％所需加入硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h以上，同时保持温度在0℃； 3000g下离心40min，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度； 分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒； (四)、应用 由于盐析沉淀后产物中盐含量较高，故一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。 思考题 蛋白质盐析沉淀后除盐采取什么方法？   二、等电点沉淀 等电点( pI )：蛋白质静电荷为零时的p H值为其等电点. 利用 蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法（Isoelectri precipitation）。 操作条件：低离子强度；pH?pI。 低离子强度调pH值至等电点，或在等电点的pH下利用透析方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。 适用于疏水性大蛋白质（如酪蛋白），对于亲水性强的蛋白质（如明胶）则不太适用。 特点： 优点：无需后续的脱盐操作。 缺点：由于操作pH过低，容易引起目标蛋白质的失活. 三、有机溶剂沉淀 定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。 例：血浆蛋白质的分离纯化，至今仍用此法 常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，因而静电吸引力增大。 操作条件： 低离子强度；等电点附近。 加入有机溶