Genomic DNA提取.pptVIP

HMW DNA 的抽提 一．药品的配制 NIB (nuclei isolation buffer) : 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM EDTA, pH 8.0 100 mM KCl 0.5 M 蔗糖 4 mM 亚精胺 1 mM 精胺 NIBT: NIB + 10% Triton? X-100。 NIBM: NIB + 0.1% β巯基乙醇。 用NIB配制1%低熔点琼脂糖。 蛋白酶K溶液：0.5 M EDTA，1% 月桂酰肌胺酸，用NaOH调节pH到9.2，使用之前加蛋白酶K到1 mg/mL。 50 mM 苯甲基磺酰氟（溶于乙醇）。 TE : 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 1 mM EDTA, pH 8.0 T10E10 : 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM EDTA, pH 8.0 二．实验步骤 将-80℃保存的样品浸泡在NIB中解冻并切成小片。 取9克解冻的样品于研钵中磨碎（样品预先用40ml NIB浸泡）。 再向研钵中加入50mL NIB，冰上放置15min，期间不时轻轻摇动。 用四层纱布，一层mira布（纱布在上）过滤，滤液转移至三角瓶中。 再用一层mira布过滤一次。 滤液在冰上放置15min，不时轻轻摇动。 将滤液转入2个50mL离心管，2000g 4 ℃离心15min。 倒掉上清液，留少许上清在管底，轻敲离心管重悬沉淀。 合并2管的重悬物到1个管中，加入50mL NIBMT混匀，2000g 4 ℃离心15min（若第一次离心的沉淀很难重悬，此次离心可适当降低速度）。 去上清，用0.5mL NIB重悬沉淀。 45 ℃温育5min。 向悬液中加入等体积的1%低熔点琼脂糖（在45 ℃中温育 ）并混匀。 将混合物用移液器转移到模具里，并把模具放在冰上放置30min。 选取2个模块(plug)，转入2mL离心管中，加入2mL蛋白酶K溶液，50℃酶解24h。更换蛋白酶K溶液再酶解24h。 T10E10(含PMSF)洗两次，每次1h。 TE洗两次，每次1h。 Plug用TE储存在4℃备用。 * * 学习动物精神 11、机智应变的猴子：工作的流程有时往往是一成不变的，新人的优势在于不了解既有的做法，而能创造出新的创意与点子。一味 地接受工作的交付， 只能学到工作方法 的皮毛，能思考应 变的人，才会学到 方法的精髓。