建立CRISPRCas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因.pdfVIP

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2016-05-13 发布于安徽
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建立CRISPRCas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因.pdf

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生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN ( ) 2015, 31 8 :219-224 建立 CRISPR/Cas9 慢病毒系统高效敲除人源 AIP1 基因 1 1 2 1 2 2 苏甲林阙彪张继勤李锦辉王敏纪卫东（1. 广州医科大学附属第一医院，广东省泌尿外科重点实验室，广州 510230 ；2. 中山大学附属第一医院，广州 510080）摘要：旨在构建AIP1 基因CRISPR/Cas9 敲除体系，获得高效、稳定、永久性AIP1 敲除的人胚肾细胞株（293T）。针对 AIP1 的外显子设计3 个20 bp 的sgRNA（sp1、sp2 和sp3）。与PX458 载体连接，构建PX458-sgRNA 敲除表达载体。T7E1 实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sgRNA 与lentiCRISPRv2 慢病毒载体连接，构建lentiCRISPRv2-sgRNA 敲除表达载体，将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T 中，收集病毒上清液转染293T 细胞。对敲除成功的293T 细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1 基因的稳定细胞株。Western blot 测定转染后293T 细胞中AIP1 蛋白的表达量。结果显示，测序证实AIP1 的3 个靶序列分别正确插入PX458 表达载体中，T7E1 实验证实AIP1sgRNAsp2 靶向敲除效率最高；成功构建lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1 敲除表达载体，并包装病毒，感染293T 细胞；Western blot 证实获得稳定的AIP1 基因表达缺失的293T 细胞株。建立了能稳定敲除AIP1 基因的 CRISPR/Cas9 慢病毒系统，成功获得AIP1 敲除的293T 稳定细胞株。关键词： CRISPR/Cas9 ；慢病毒；AIP1 ；稳定细胞株 DOI ：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2015.08.032 Establishment of a CRISPR/Cas9 Lentiviral System for Knockout Gene AIP1 of Human 1 1 2 1 2 2 Su Jialin Que Biao Zhang Jiqin Li Jinhui Wang Min Ji Weidong （1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University ，Guangdong Key Laboratory of Urology ，Guangzhou 510230 ； - 2. The First Affiliated Hospital of Sun Yat sen University ，Guangzhou 510080 ）： This work aims to estab