节瓜ISSR-PCR反应体系的建立及正交优化.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第 期 2014 9 节瓜 ISSR-PCR 反应体系的建立与正交优化 赵芹  谢大森  罗少波  彭庆务  李明珠  李海达 （广东省农业科学院蔬菜研究所，广州 510640） 摘 要 ： 旨在开展节瓜种质资源分类鉴定与遗传多样性研究。通过正交试验设计与单因素分析相结合的方法，对节瓜 2+ ISSR-PCR 反应体系5 个因素 （模板DNA 浓度、dNTP 浓度、Mg 浓度、引物浓度与 聚合酶浓度）在4 个水平上进行优化分 Taq 析，建立了节瓜稳定可靠且具丰富多态性的最佳反应体系，进而对引物退火温度进行梯度试验分析。结果表明，20 μL 节瓜ISSR- PCR 最佳反应体系为70 ng 模板DNA、0.2 mmol/L dNTP、1.2 mmol/L Mg2+ 浓度、0.96 μmol/L 引物、0.8 U Taq DNA 聚合酶和2.0 μL 10×buffer ；引物IS807 最佳退火温度为53℃。 以此为基础，利用4 条引物对4 份节瓜种质进行最佳反应体系稳定性验证，证明该 体系稳定可靠、扩增谱带清晰、多态性丰富且重复性较好。 关键词 ： 节瓜 ISSR-PCR 正交优化 梯度PCR 退火温度 - Establishment and Optimization of an ISSR PCR Reaction System for - Chieh qua Using Othogonal Design Zhao Qin Xie Dasen Luo Shaobo Peng Qingwu Li Mingzhu Li Haida （ ， ， 510640 ） Vegetable Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou Abstract: It was to identify and classify chieh-qua germplasm resources. The main factors affected ISSR reaction was tested to optimize ISSR amplification system. In this research, the orthogonal design and single-factor gradient method were used to establish and screen chieh-qua ISSR-PCR system for 4 levels of 5 factors（DNA template, dNTPs, Mg2+ concentration, primer, and Taq DNA polymerase）respectively, and then annealing temperatures were proposed by gradient PCR