第五基因工程载体.ppt

* 腺相关病毒载体（AAV）：属于非致病的微小 病毒科家族的成员，只有依赖于辅助病毒才能繁殖。 特点： 基因组小，只有几个kb； 无致病性； 免疫原性弱； 装载外源基因容量小，不超过5kb； 制备过程复杂 ； * 痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。长期被用作预防天花的疫苗。 病毒基因组中有很大的非必需区（28kb），可以切除，代之以较大的外源基因，或者同时插入几个外源基因，构成多价疫苗。 * 哺乳动物细胞基因转移的选择标记 氨基糖苷磷酸转移酶：G418 二氢叶酸还原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤） 胸苷激酶（TK）： APT （氨基喋呤） 潮霉素-B-磷酸转移酶（HPH）：潮霉素-B 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）： 霉酚酸 腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）： * 嘌呤和嘧啶合成知识的回顾 哺乳动物细胞内的两条合成途径 1 从头合成：利用各种小分子，如氨基酸、CO2、NH3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶环，进而合成核苷酸。 2 补救合成途径：利用细胞内原有的或从胞外吸收的碱基、核苷、核苷酸。 * 1.从头合成途径：利用小分子 合成核苷酸，包括胸苷酸 2.补救合成途径： 利用细胞内现有的碱基、磷酸 合成核苷酸，包括胸苷酸 氨甲喋呤可阻挡此途径 胸苷激酶等 * 当培养基中混有氨基喋呤时，会干扰细胞从头合成嘌呤和嘧啶的代谢途径。TK+细胞可利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，由此可以存活。而TK-细胞不能利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，因而死亡。 * 如 胸苷 胸苷激酶 TK 胸苷一磷酸 若一细胞株缺乏胸苷激酶，则标示为TK－细胞，此种细胞若被置于混有氨基喋呤和胸苷的培养基中，将无法存活。而TK＋阳性细胞可存活。 当TK－细胞转入了外源的胸苷激酶基因，则在混有氨基喋呤和胸苷的培养基中，可正常生长。 * 第五节 昆虫细胞表达载体 杆状病毒是许多昆虫的天敌，应用杆状病毒作为昆虫细胞表达载体，用途越来越广。 基因组特点：较大，约100－150kb，其中的多角体蛋白编码基因是复制的非必需区，启动子功能强大。可将外源基因插入其内。 后又发现最晚期表达的一种蛋白质，其编码基因也是复制非必需区，可用作外源基因插入区域。 * 杆状病毒载体的优点 1. 容量大，外源基因可达100kb 2. 具有强启动子 表达水平高，最高可达50％ 3. 具有对表达蛋白质的修饰功能，表达产物 生物活性高。 4. 可将表达产物分泌到细胞外。 5. 较易培养，生产成本低。 6. 安全 ，只感染昆虫细胞，对人畜无害。 * pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型) 常用表达载体 pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs) * Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin **帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 各种融合蛋白表达载体 帮助可溶化 帮助分泌到周质 可用亲和层析纯化 * * λ噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对λ噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。 λ噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如Bam