《分子生物学实验》要点.doc

分 子 生 物 学 实 验 指 导 书 安徽农业大学生命科学学院遗传教研室 二00三年元月 前 言 随着生命科学的发展，分子生物学技术已渗透到生命科学的各个研究领域，因而分子生物学实验技术也成为高校生物学及其相关学科专业学生应该了解和掌握的技术。过去在高校生物技术等本科专业开设分子生物学实验多以质粒DNA为材料，且往往与基因工程操作技术内容有重复。近年来，基因组学研究的进展，特别是与生物学研究和应用密切相关的分子标记技术越来越广泛地得到应用，而这些技术是建立在基因组DNA分子操作和分析技术之上的，这就迫切需要学生了解基因组DNA分子操作技术，所以本实验系统在内容和体系上进行改革，以植物基因组DNA为对象，建立一套基因组DNA提取、检测、扩增、酶切、杂交和特异片段回收等常用分子生物学实验技术，一方面避免与基因工程内容的交叉重复，更重要的是帮助学生了解和掌握生物基因组DNA基本的分子操作技术，以拓展和更新实验内容，提高学生动手能力和创新意识。 目 录 实验一 植物基因组DNA的提取 ………………………………………3 实验二 植物基因组DNA的鉴定 ………………………………………4 实验三 植物基因组DNA的酶切、电泳及转膜 ………………………6 实验四 Southern杂交 ……………………………………………………8 实验五 随机PCR扩增反应与RAPD分析……………………………10 实验六 特定片段的分离回收与纯化 …………………………………12 附 录 各种试剂和缓冲液的配制 ……………………………………14 主要参考文献 ……………………………………………………………15 实验一 植物基因组DNA的提取 原理及目的 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分 离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。当加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此提取基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿的抽提、混匀操作要温和，以保证得到较长的DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带有合适末端的有效片段很少，而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。 不同生物（植物、动物和微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获取可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此对富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以玉米嫩叶为材料，用SDS法提取基因组DNA。 设备 液氮罐，微量移液器，台式离心机，恒温水浴锅，研钵，7ml离心管等。 试剂 1. 提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl、1.5% SDS。 2. 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16） 3. TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0） 4. 其他试剂：液氮，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，3mol/L NaAc（pH5.2）。 操作步骤 1. 在7ml离心管中加入2ml提取缓冲液，60℃水浴预热。 2. 取玉米幼叶0.5~1g，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，摇动混匀，60℃水浴保温30~60min（时间长，DNA产量高），不时轻轻摇动。 3. 加入2ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5~10 min，使水相和有机相分层。 4. 室温下5000rpm离心5 min。 5. 小心移取上清液至另一7ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净的吸水纸上吸干，放入含200μl TE的离心管中。若絮团太少，亦可直接在室温下5000rpm离心5 min，去除上清液，再加入200μl TE溶解沉淀。 7. 加入1μl RNaseA (10μg/μl), 37