分子生物学实要点.doc

实验二 目标菌株的筛选 一、实验目的 1、确定目标样品； 2、对目标样品中的微生物进行筛选； 3、理解实验原理，尤其是操作步骤和药品的作用； 4、养成实验态度严谨、正确记录实验过程、灵活分析并解决问题的素养。 实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 从含有多种微生物的自然材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由单个个体繁殖而来的，故可获得纯种。这种获得单个菌株纯培养的过程称为微生物的分离与纯化。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛和最普通的细菌基础培养基，又称普通培养基。它含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCI提提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。?由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至碱性，以利于细菌的生长繁殖。? 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：?牛肉膏?3.0g? NaCI??5.og? 蛋白胨?10.0g 琼脂20g 水?1000ml? pH7.0～7.2 三、实验材料与用具℃,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。? （7）搁置斜面? ?将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长?1/3。? （8）无菌检查? ??将灭菌培养基放入37℃的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。? 2、取样 连续稀释分离法 （1）稀释土样 制备土壤悬液：称表层以下5～10cm处土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。 注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。 （2）接种：从稀释液（10-8）各吸取1 mL分别加到2个牛肉膏培养皿 （3）倒平板：将培养基加热融化，待冷至55～60℃时，右手持三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液混合并均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，静置凝固。 （4）平板划线法纯化菌株 将融化的培养基制成平板，冷凝后，左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接种环取稀释样品一环在平板上划线。 3、样品中微生物的培养 恒温培养 将分离细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）的培养皿置于（倒置）28～30℃恒温箱中，培养24小时； 4、样品中微生物的纯化。 观察生长的菌落，并进一步纯化分离或直接转接斜面。 实验三 基因组DNA的提取 一、实验目的 1、学会微生物总DNA的提取方法； 2、熟练操作高速冷冻离心机、移液器； 3、理解实验原理，尤其是操作步骤和药品的作用； 4、养成实验态度严谨、正确记录实验过程、灵活分析并解决问题的素养。 实验原理 利用溶菌酶能够水解大肠杆菌的肽聚糖壁，从而破碎细胞。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀即为基因组DNA。 核酸制备的一般方法和原理 1、核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如