时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值.docVIP

时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值 　　[摘要]目的对时间分辨荧光免疫法检测脑脊液结核分枝杆菌特异性抗原的诊断价值进行研究。方法整群选取2012年6月-2013年6月于该院确诊为结核性脑膜炎患者48例，收集患者的脑脊液，建立时间分辨荧光免疫分析法检测脑脊液中ESAT-6-CFP10抗原。同时采用TRIFA法和ELISA法对结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度进行检测。结果ESAT6/CFP10的TRIFA法稳定性好，线性宽，其检测灵敏度为2.5ng/mL，平均回收率为97.6%，批内变异系数平均为3.35%，批间CV平均为5.32%。TRFIA法结核性脑膜炎患者脑脊液检查特异度为92.6%，明显高于ELISA法的82.4%，差异有统计学意义（P2=5.5311）。结论TRFIA法敏感度、精密度、重复性、线性相关性较好，检测脑脊液中ESAT-6-CFP10抗原对诊断结核性脑膜炎有很高的敏感度和特异度。 中国论文网 /6/view-7155161.htm 　　[关键词]时间分辨荧光免疫法：检测：脑脊液：结核分枝杆菌：特异性抗原 　　[中图分类号]R378.9 　　[文献标识码]A 　　[文章编号]1674-0742（2015）07（c）-0074-02 　　结核性脑膜炎（TBM）是临床上比较严重的致命性的结核病类型之一，患者患该病时，预后比较差，往往可能会危及生命安全。目前来说，结核性脑膜炎诊断的金标准是在患者的脑脊液中检测到结核分枝杆菌（MTB）的存在。在感染早期，致病型结核分枝杆菌一般会分泌大量的特异性蛋白，即6000-早期分泌性抗原靶（ESAT-6）与抗原培养滤液蛋白10（CFP10）.并且这两种蛋白不存在在卡介苗BCG中，故其可以作为活动性结核的标志物。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法是以镧系元素为示踪物，代替荧光物质酶同位素化学发光物质，标记抗体抗原激素多肽蛋白质核酸探针及生物细胞，大幅度降低了非特异性结合并提高了灵敏度，其灵敏度高，稳定性和，而且检测限也比较宽，故通过建立检测ESAT6/CFP10融合蛋白的TRFIA方法，探讨其是否能够很好的用于结核性脑膜炎的诊断。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　整群选取2012年6月-2013年6月于该院进行治疗的确诊为结核性脑膜炎患者48例，其中男25例，女23例，年龄22～66岁，平均年龄（43.4±3.5）岁。根据病史、辅助检查、短期抗结核治疗效果临床诊断为结核性脑膜炎。 　　1.2 试剂与仪器 　　DR6608型TRFIA检测仪由中山大学达安基因股份有限公司提供；Eu3+标记试剂盒及发光增强液购于美国Wallac公司；96孔微孔板购于美国cormng公司；结核分枝杆菌ESAT6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒由上海宝曼生物科技有限公司提供；ESAT6/CFP10融合蛋白及其单克隆抗体（IgG）与多克隆抗体（IgG）由上海博研生物科技有限公司提供。 　　1.3 方法 　　常规腰椎穿刺抽取患者脑脊液2mL.每管0.5mL分装，存放于-20℃待分批测定CFP10和ESAT-6.所有操作均严格按照操作说明书进行。运用双抗体夹心法，先在微孔内包被一层ESAT-6-CFP10融合蛋白单克隆抗体，然后加入100uL各浓度的标准品和样品，在常温下振荡孵育th，洗涤3次，5min/次，然后加入稀释100倍的Eu3++-抗ESAT-6-CFP10融合蛋白多克隆抗体100uL，常温下振荡孵育th，洗涤6次，5min/次，再加入100uL增强液，孵育5min，将其放入时间分辨荧光仪进行荧光检测，进行标准曲线的测绘，然后根据方程进行样品中ESAT-6-CFP10二聚体蛋白的含量的计算。 　　1.4 统计方法 统计学软件为SPSS15.0，计数资料采用X2检验，检验水准为a=0.05.P2=0.9959。而且从图可以得出，ESAT-6-CFP10二聚体蛋白的含量与荧光计数成正比关系。 　　2.2 回收 　　试验在浓度为5.4 ng/mL的ESAT6/CFP10的1mL健康人血清中，分别加入各1mL浓度为25、200、400 ng/mL的ESAT6/CFP10标准品，计算样本回收率。回收率分别为96.9%、98.5%、98.3%，平均回收率为97.6%。 　　2.3 精密度 　　在荧光计数值高、中、低值中随机选取3份ESAT-6-CFP10样品，每天平行测定20孔，计算批内变异系数CV，得出结果分别为4.3%、3.2%、2.6%，平均为3.35%；连续检测20个工作日，计算批间变异系数cV，得出结果分别为5.6%，5.21%、4.9%，平均为5.32%。 　　2.4 灵敏度 　　选取不同浓度的ESAT6/CFP10融合蛋白