生物技术制药——第四章抗体制药分析报告.ppt

3.抗体导向酶-前药疗法 抗体导向酶——前药疗法(antibdy-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT)是利用抗体作为载体将前药的专一性活化酶选择性地结合于肿瘤部位，使无毒性的前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，杀伤肿瘤。 有效地解决药物在肿瘤组织内浓度过低和对正常组织损伤的问题。 三、毒素偶联的抗体药物 ⒈免疫毒素及其换代制品 在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。 第一第二代免疫毒素都是通过化学交联法制备，方法复杂，产量低，安全性差，并且由于相对分子质量大，对肿瘤细胞的渗透性差，还容易引起机体针对免疫毒素的中和反应，其连接键的不稳定性在体内加速免疫毒素的降解，而毒素部位含有的糖残基也使得免疫毒素在体内很快被清除。 第三代免疫毒素--重组免疫毒素。用基因克隆方法改造毒素基因，再和小分子抗体基因重组表达而获得。由于经改造去除了了非特异性结合部位，明显降低了毒性反应。 特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。 噬菌体抗体库的构建 4??特异性抗体片段的筛选?? 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用，展示在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，通过“吸附-洗脱-扩增”的淘选，可有效地从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因。除此之外，也有用捕获淘选、完整细胞淘选、组织淘选及器官淘选系统获得结合抗体成功的报道，为噬菌体抗体的淘选增添新的途径。 噬菌体抗体库技术的优点 1、噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库，不需要免疫人和动物，提供了不经免疫制备抗体的可能 2、DNA操作是在细菌中进行，避免了人工免疫和杂交瘤技术，比杂交瘤技术简单快速，适应于大规模工业化生产，因而使人们随心所欲地制造抗体的愿望成为现实 3、噬菌体抗体库技术对提高抗体亲和力具有巨大的潜力，能够模拟抗体亲和力成熟过程，可通过链置换、 PCR错配或随机致突变技术改变抗体亲和力。尽管提高抗体亲和力的新技术不断出现，然而如何有效获得高亲和力抗体仍是抗体库研究的核心课题之一，也是基因工程抗体能否应用的关键。 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 接头DNA VH VL 图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 ⒈获取目的基因 ⒉抗体库技术的载体 ⒊淘筛 ⒋表达与鉴定 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 二、噬菌体抗体库技术的特点 ⒈模拟天然全套抗体库 ⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊可获得高亲和力的人源化抗体 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 该项技术对抗体基因筛选的范围广，不需要复杂的基因工程技术，技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 该技术适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 基因工程抗体表达 ⒈原核细胞表达：融合表达和分泌表达 ⒉真核细胞表达：都是分泌表达 ⒊转基因植物表达：烟草 ⒋转基因动物表达：单基因水平 见p160 第六节 抗体诊断试剂 抗原和抗体的特异性结合在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病