蛋白质与酶工程第六章酶的固定、修饰与改造要点解读.ppt

（三）酶的异源表达 1. 酶基因在原核生物中的表达 （1）原核生物基因表达系统的特点 ① 只有一种RNA聚合酶； ② 表达是以操纵子为单位的； ③ 转录与翻译偶联，是连续进行的； ④ 一般不含内含子； ⑤ 基因表达控制主要在转录水平； ⑥ 大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上含有真核生物缺乏的转译起始密码子及SD序列。 （2）原核生物基因表达载体： （3）影响原核生物基因表达系统表达效率的因素：很多；如启动子结构、转译起始序列、启动子同克隆基因间的距离、质粒拷贝数及稳定性等等。 2. 外源基因在真核细胞中的表达： 真核生物表达载体（主要是穿梭载体）、受体细胞（如酵母细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞等）。 3. 酶异源表达的应用 非常广泛。 （1）农业：作物改良（抗病、抗虫、抗逆等）； （2）工业：生产用酶的制造。 （3）医学： （4）环境保护： （5）能源： 二、酶分子的改造 （一）酶的定点突变 （二）酶分子定向进化 （一）酶的定点突变（site-directed mutagenesis;SDM） 酶的定点突变（site-directed mutagenesis; SDM）是指在基因的特定位点引入突变,即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中的某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对地物的亲和力，增强酶的专一性等。 1. 寡核苷酸引物突变 （1）制备待突变基因并克隆到突变载体上； （2）制备含待突变基因的单链模板； （3）突变寡核苷酸引物欲待突变核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链DNA； （4）合成突变链： （5）转化和初步筛选突变的异源双链DNA分子。 2. PCR介导的定点突变 PCR介导的定点突变 3. 盒式突变 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列。 突变序列含有黏性末端，靶DNA区段需存在一对限制性内切酶位点。 （二）酶分子定向进化 酶分子的合理设计(rational design) 酶分子的定向进化(directed evolution) 酶分子的合理设计(rational design) 酶分子的定向进化(directed evolution) 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’→ 5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化 = 随机突变 + 选择。 前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 定向进化的方法 1. 易错PCR 2. DNA重组 3. 外显子改组 4. 随机引物体外重组法 5. 交错延伸法 酶的体外定向进化应用实例 1. 提高催化活力； 2. 提高稳定性； 3. 提高底物专一性； 4. 改善其它性能。 三、融合酶 是指将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白。从广义上讲融合酶属于杂合酶。 融合酶是吸收了杂种优势的思想，把不同酶中的部件有机的组合在一起，从而在分子水平上出现了“杂种优势”。 途径：第一种方法是非理性设计法，主要是通过构建库，再从中筛选出所需要的融合体；第二种方法是合理设计法，要求对操作对象的结构和功能有一个全面的了解，才能实现几个蛋白的交换、融合。 策略：二级结构融合、功能域融合、整个蛋白融合。 半抗原是指能与对应抗体结合出现抗原-抗体