酶分子修饰与模拟分析报告.ppt

二硫键的化学修饰 二硫苏糖醇（DTT） （巯基的还原剂） 酰化剂 DTT即DL-Dithiothreitol，为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，分子量为154.25。常用还原剂，有抗氧化作用。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。 氨基的化学修饰 三硝基苯磺酸（TNBS） 琥珀酸酐 DNFB 丹磺酰氯 DNS 修饰剂使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法。 羧基的化学修饰 碳二亚胺 修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应。 应用比较多的修饰方法（I） 1）. 酶的表面化学修饰 1 . 大分子修饰：可溶性大分子，其中相对分子量在500-20000u范围内的PEG（聚乙二醇）类修饰剂应用最广，既能溶于水，又可以溶于大多数的有机溶剂，它一般没有免疫原性和毒性。化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG 。 PEG的分子式： OH-CH2- CH2-O-CH2 n-CH2-OH 特点：分子线性；具有较好的生物相容性；在体内部残留，无毒性和抗原性。 利用PEG修饰酶的显著特点是：能消除酶的抗原性。 （1）琥珀酸酐法 活化反应在碱性条件下进行，产物与酶分子上-NH2产生交联反应。 a. PEG活化反应 二溴代琥珀酸酐作为活化剂 PEG-OH + Br-CH-C 搅拌过夜（OH-） Br-CH-C PEG-O-CO-CHBr-CHBr-COOH o o o 活化的PEG b.修饰反应 PEG-O-CO-CHBr-CHBr-COOH + H2N-酶 PEG-O-CO-CBr-CH-酶 COOH 修饰酶 还有：羰二亚胺法；重氮法；三氯均嗪法；叠氮法等 应用比较多的修饰方法（II） 2 .小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已经被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，邻苯二酸酐等。 3 .交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛，PEG等将酶蛋白分子之间，亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。 4 .固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境的改变，会使酶的性质（最适pH，最适温度，稳定性等）改变。 应用比较多的修饰方法（III） 2）.酶分子内部修饰 1 .非催化活性基团的修饰 2 .蛋白主链的修饰 3 .催化活性基团的修饰 4 .与辅因子相关的修饰 作业？ 如：氨基酸置换修饰 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 应用比较多的修饰方法（IV） 3）.结合定点突变的化学修饰 通过一些可控制的方法在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶（CMM 的新型酶。 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。 酶分子的定点突变 1、基因序列分析 2、蛋白质结构分析 3、酶活性中心分析 4、引物设计进行基因定点突变 5、酶基因克隆表达 6、变异特性分析 3、酶化学修饰的应用 酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性； 4.产生新的催化能力； 在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长 它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性 和抗原性。 在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱 和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学 性质。 在酶结构功能研究中： 1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究； 2.确定氨基酸残基的功能； 3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。 酶化学修饰的应用 1、研究酶空间结构