酶联免疫吸附试验(ELISA)在食品安全快速检测上的应用分析报告.ppt

酶联免疫技术与食品安全快速检测 姓名:陈超 学号：201423104001 目录 ELISA概述 ELISA的常用方法 ELISA的应用 一、ELISA概述 酶联免疫吸附试验 (ELISA) ：是在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。 主要是利用抗原与抗体的高特异性反应，通过合适的载体，使酶标抗原或抗体与待测样品反应，形成酶标抗原抗体复合物，在相应的酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使之水解成有色物质。一定条件下，呈色物质与待测物的含量直接相关，因此可以根据呈色物质颜色的深浅，对待测样品进行定性定量分析。 基本步骤（以双抗体夹心法为例） 包被：将Ab包被到酶标板上,进行洗涤 封闭：封闭酶标板上的非特异结合位点 加样：将标准品、样品、阴性及空白对照样品加入酶标板，洗涤 加酶标抗体：加入酶标记的二抗，洗涤 显色：加入底物，在酶作用下发生显色反应 检测：检测有色溶液在490nm波长下的OD值 结果分析：绘制标准曲线，分析受检样品浓度 常用的标记酶有：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、碱性磷酸酯酶等。 这一类酶通常满足以下条件： 具有较高的催化专一性和活性 与抗原抗体偶联后不影响自身酶活性和抗原抗体的免疫活性 催化反应的信号产物易检测 价廉易得 对人体无害 二、ELISA的常用方法 夹心法 间接法测抗体 竞争法 三、 ELISA快速检测技术在食品安全检测中的应用实例 水产品中残留氯霉素的测定 氯霉素，是一种广谱抗菌素。氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫癜 、粒细胞缺乏症 、再生障碍性贫血，腹胀、腹泻、食欲减退，口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。另外还可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。 检测原理： 竞争法测抗原 即游离氯霉素与氯霉素酶联记物竞争氯霉素抗体结合位点 具体方法： 酶标板包被有针对兔IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。 加入氯霉素抗体、氯霉素酶联记物、氯霉素标准或样品溶液。 氯霉素抗体与固定的羊抗体结合。 游离氯霉素与氯霉素酶联记物竞争氯霉素抗体结合位点。 没有结合的氯霉素酶联记物在洗涤步骤中被除去。结合的氯霉素酶联记物将无色的酶底物转化为蓝色的产物，加入反应终止液后使颜色由蓝变成黄色。用酶联分析仪于波长450nm下进行吸光度测定。 ELISA是测定水产品中氯霉素含量的一种好方法。由于酶的专一性催化作用，酶标板上多份样品同时检测，故操作简单，灵敏度，精密度较高，是测定水产品中氯霉素含量的一种好方法。 应用前景 目前用于食品安全性检测的方法有很多，常见的有： ELISA检测技术 微生物学方法 薄层色谱法 气象色谱法 高效液相色谱法 PCR技术 核酸探针技术 抗原的制备 抗原：是指能够引起机体特异性免疫应答，并能与相应抗体发生特异性反应的物质，即同时具有免疫原性和抗原性。 半抗原：具有免疫原性的物质也必然具有抗原性，不具有免疫原性只有抗原性的物质称为半抗原。半抗原相当于一个抗原决定簇，即只具有抗原性，能与抗体结合，但不具有免疫原性，不能诱导机体产生免疫应答。 一般认为，分子量越大，抗原的表面决定簇越多，越有利于免疫应答的产生。 农药一般为不含蛋白质的小分子化合物，是只具有抗原性的半抗原，在进行免疫分析之前，还要对其进行结构修饰，使之成为可用的半抗原。典型的半抗原结构中应具备适当末端活性基团，如一NH z、一COOH、一0H、一SH等，可直接与载体偶联；与载体连接后应保证该特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性和亲合性的抗体；同时还需相应地突出特定农药的结构或者一类农药中共有的结构特征例。 半抗原修饰好后，一般要与合适的载体蛋白以共价键偶联，使之具有免疫原性，称之为人工抗原。如果农药分子上不具有所需的活性基团，则需利用化学方法引入制成半抗原，再与载体偶联。 常用的载体蛋白有牛血清白蛋白、卵清蛋向、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、甲状腺球蛋白、猪血清白蛋白等。常用的偶联方法有：混合酸酐法、碳二亚胺法、重氮化法、戊二醛法等。 抗体的制备 抗体：是机体受到抗原刺激后，机体体液中产生的能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。 较为常见的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体。 多克隆抗体是经特定的抗原免疫动物后得到的抗血清抗体，是免疫分析中常用的抗体类型。 单克隆抗体：由单个B细胞增殖形成的群落产生的结构相同、功能均一的抗体称为单克隆抗体。 多克隆抗体的特异性、稳定性以