病毒和健康3__病毒的纯化、检测1.ppt

病毒的纯化、检测和病毒病的诊断方法 病毒的纯化 Stanley 在1935年首次提纯TMV 病毒纯化对病毒学发展所起的作用十分巨大. 病毒的纯化前的预备工作 1.繁殖病毒 自然感染病毒的生物体的器官组织或细胞 的量往往难以满足提纯需求,需要用人工接 种寄主来大量繁殖病毒. 病毒的纯化前的预备工作 首先要选择最适合的寄主 对植物病毒,长期以来都是接种整体植物 一般说,用机械摩擦接种比昆虫媒介或嫁接等方法简便. 病毒的纯化前的预备工作 利用生物学方法纯化病毒 采集自然感染的生物体组织器官作原材料来提纯某种病毒时,混合感染的概率很大 生物学纯化:病毒在很多植物或动物细胞上产生一个个单个病毒株体 病毒的纯化前的预备工作 病毒纯化的基本原理 病毒的释放和萃取 病毒颗粒主要存在与寄主组织细胞内,因此提纯的第一步是设法破碎寄主感病的细胞 病毒纯化的基本原理 大多数病毒毒粒的等电点在PH4.0左右,而最稳定、溶解度最大是在PH7.0左右 此时可用0.1mol/L磷酸缓冲液来处理 一般破碎细胞、萃取以及以后各提纯步骤都在4℃左右进行操作。 病毒萃取液的分级纯化 清除较大的细胞器 去除较大的细胞组分如：细胞核、线粒体、叶绿体和细胞壁等 病毒萃取液的分级纯化 去除寄主蛋白质 1、沉淀法 用各种沉淀剂来沉淀，最常用的是硫酸胺，其溶解度高，更经济。 不同饱和度的硫酸胺可沉降水合化程度不同的病毒或蛋白质 病毒萃取液的分级纯化 范围广泛的有机化合物的亲水性程度不同，通过与蛋白质竞争水分，使蛋白质脱水而沉淀。最常用的是乙醇和丙酮。 病毒萃取液的分级纯化 离心法 由于大多数病毒颗粒在某种介质内的沉降速度与寄主组分有差别，使用离心法可有效地纯化病毒。 病毒萃取液的分级纯化 差速离心法 差速离心即将低速离心所得澄清液进行超高速离心，使大部分可溶性蛋白质和小分子化合物留在上清液中，而病毒颗粒等则保留在沉降物中 病毒萃取液的分级纯化 密度梯度离心 先在一个吊篮式离心管内由下而上铺以浓度递减的惰性致密介质，如蔗糖、甘油等 病毒萃取液的分级纯化 凝胶色谱法 这是利用化合物分子大小和扩散速率来区分它们的方法 病毒萃取液的分级纯化 电泳 一般较少用电泳方法制备病毒，因制备量少且繁杂。 病毒的检测 定性或定量的病毒检测的理论依据是病毒的理化性质，不同的方法所依据的性质不同，因此，检测结果也不一定完全相同。 侵染力的测定 侵染力的测定是对病毒活性的测量，也就是病毒与寄主特异反应的测定。 定量测定病毒活性又称滴定。与寄主产生某种反应所用最小病毒量叫侵染单位。 侵染力的测定 某病毒制品的效价是指每单位体积中侵染单位的数量。 动物病毒的滴定方法是计量病毒在铺满的菌落层或动物单层细胞上产生的噬斑或浊斑数。 侵染力的测定 一个病毒悬浮液的效价是以单位体积内的侵染单位来表示，在一定条件下即相当于毒粒数目。 病毒的培养 1、原代细胞 猴肾细胞、兔肾细胞、人胚胎肾细胞 2、二倍体细胞 纤维原细胞 3、连续细胞系 RD、MDCK、LLC-MK2 血清学方法 病毒颗粒产生免疫原性的活性部分主要是外壳蛋白表面上的抗原决定簇. 1、免疫沉淀法 抗原和抗体在有电解质存在下可以特异地结合形成沉淀 血清学方法 中和试验 此法常用于测知人、畜体内是否有中和抗体存在，及其该中和抗体的效价。 血清学方法 补体结合试验 此法主要利用补体的两个特性：一是可与任何抗原—抗体复合物结合；二是免疫裂解反应必须有它的参与。 血清学方法 凝胶扩散法 在琼脂凝胶中扩散的病毒或其抗原与其抗体相遇形成沉降带 血清学方法 酶联免疫吸附测定法 酶标记的抗原或抗体间的特异性反应，并通过检测酶的颜色反应而定性定量检测抗原或抗体的方法。 病毒核酸检测 这类诊断方法针对的目标是病毒的基因组核酸 病毒核酸检测 杂交法 关键原理是在已知病毒基因组全序列或部分序列基础上，针对某段特定序列设计一段与该序列互补的核酸序列，又称为探针。进行检测时，必须对探针进行标记。 病毒核酸检测 聚合酶链反应 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 病毒核酸检测 反转录PCR 技术核心是在逆转录酶的催化作用下，将RNA病毒的基因组通过随机引物逆转录为cDNA后，再经过PCR过程将cDNA进行扩增。 病毒核酸检测 依赖核酸系列的扩增 支链核酸信号放大系统 信号检测技术和即时PCR 其他衍生PCR技术 微阵列技术 病毒病核酸分子检测的优化和质量控制 实验室内的区域设置 尿苷酶防污染技术 检测对照的设置 核酸扩增检测系统的优化 核酸样品的分离纯化 SARA 传染性非典型肺炎是一种急性的呼吸系统感染，世界卫生组织(WHO)将其名称公布为严重急性呼吸道症候群(SARS)。SARS是由一种新病原引起的，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集