transfection分析.pptx

从分子到细胞，我们如何去思考？;Question：;DNA重组DNA Recombination ;重组DNA技术相关概念;DNA克隆;DNA克隆的基本原理;细胞转染技术;概念;转染的分类;方法;1.磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转染效率通常很低。 影响因素： DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量 共沉淀物与细胞接触的保温时间 甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间等。  一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度的DNA(1～50ug/ml)。DNA磷酸钙共沉淀物同细胞接触的最适保温时间，因细胞的类型而异。促进因子通常是在DNA-磷酸钙共沉淀物被细胞吸收4～8小时之后再加入。 ;2. 脂质体介导法（目前应用最广泛） 原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。 ;阳离子脂质体介导的转染;3、电穿孔法;准备DNA: 构建?提质粒?线性化? 准备细胞：0.5～1×107 将细胞、DNA加入电极杯 冰上预冷（！） 设置电脉冲参数?电击 常温静置 转移细胞至培养皿 24－36小时后加筛选药物 ;4、病毒感染;常用病毒载体;DNA病毒载体 腺病毒相关病毒载体 疱疹病毒载体;慢病毒 ;慢病毒载体;包装成分 由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 ;载体成分 与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。;包膜蛋白 采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的 包膜。 这样做的结果至少具有三个方面的积极意义： ①包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒的可能； ②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞； ③VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使慢病毒载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。;包装成分 包装成分的构建应在不重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。Naldini等在构建包装质粒时，阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。;载体质粒 载体质粒??HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。;转染的过程;靶细胞的准备;靶基因质粒DNA的准备 1、重组质粒的纯度OD260/OD280 2、重组质粒的浓度;转染与分析 1、GFP的表达 2、WB;Example：;自Gene Bank获取基因序列;设计合成ORF Primer（含酶切位点） ;基因A在内皮细胞中获得表达