蛋白质生化技术分析.ppt

蛋白质芯片-飞行质谱系统及其在分子生物学中的应用 背景介绍 蛋白指纹质谱技术（SELDI，Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization，表面增强激光解吸技术）是 2002年诺贝尔化学奖的核心技术，具有快速、简单和灵敏等优点,它不仅可在肿瘤诊断中用于发现标志物、观察治疗效果,还可用于研究蛋白质的修饰、相互作用、信号传导和酶促调节等,从而实现在蛋白质水平的大规模功能研究。 传统蛋白组学研究（2D-MS）的局限性 由于外加电场下的PH梯度不稳定，重复性差 加样量小，分离的蛋白质很难鉴定 可分析的蛋白质最多约1500种，难以检出蛋白质中占很大比例的低丰度蛋白质 对于分离跨膜蛋白仍是技术难点 电泳胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白，以依次鉴定单个蛋白斑点为基础，限制了检测通量 消耗时间长，一次电泳要5小时以上 对技术水平要求高，不能完全自动化 染色转移等环节操作技术条件要求高，耗时，不适应于大规模筛查和临床检测 SELDI技术的优势 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 同时快速发现多个生物标记物 微量样品 (as few as 2000 cells for LCM samples) 高通量的验证能力（ with 1000s of samples a month） 发现低丰度蛋白质 测定疏水蛋白质: 与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 ：利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量 可以定量：利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不用于定量分析 功能广 ： I.利用单克隆抗体芯片, 可替代 Western Blot II. 利用单克隆抗体芯片, 可互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原, 而且灵敏度远高于流式细胞仪 系统介绍 SELDI技术的蛋白质芯片－飞行时间 质谱仪器由三部分组成： 蛋白质芯片阅读器（Protein Chip Reader） 飞行时间质谱检测系列（PBSIIC系列） 分析软件（Protein Chip软件）。 操作流程示意图 SELDI蛋白质芯片的制备 生物初样品（血清/细胞裂解液）：蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上； 清洗蛋白质芯片：用水洗去非特异性结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰； 加能量吸收分子 EAM（Energy Absorb Molecule） or “Matrix”：芯片 经室温干燥后，加能量吸收分子 EAM到每个 点上，使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解吸附和离子化 飞行时间质谱检测 激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来 电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱被精确地测定出它们的质量 Protein Chip Reader工作草图 Protein Chip 软件 化学表面芯片 生物表面芯片 生物表面芯片分为抗体－抗原、受体－配体和DNA－蛋白质芯片等种类，可显示与之相结合的抗原或者配体的不同分子量亚型，这种芯片的特异性高，可以定量。 蛋白质芯片系统提供了一个单一、快速和特异的平台，成为蛋白质组学研究的多个领域的强大平台。 能够用于下列研究：生物标志物发现、表达差异绘图、作用差异绘图、抗体抗原作用、DNA与蛋白的相互作用、蛋白鉴定和多肽作图、蛋白质纯化、表位作图、糖基化分析、磷酸化/信号传导途径分析、蛋白与蛋白之间作用、受体配体作用、毒性标志物发现、临床数据分析等。 在发现生物标志物上的优势 抓住了疾病的本质，绝大多数疾病都有特异的生物标志物（Bio-marker），在SELDI技术中质谱的峰值是对这些生物标志物最直接的反映。 有一套灵敏的检测系统来检测和识别这些微量的生物标志物 。 发现生物标志物 能够对许多不同的样品进行比较分析，软件功能强大，分析获得的谱图可以多种形式表示，并应用叠加合成等手段筛选出特别的差异峰，从而确定生物标志物，该方法迅速便捷。 蛋白质纯化 提供了便捷的蛋白质纯化方法，能够优化最佳色谱条件（如PH值、洗脱条件），对目的蛋白质进行有效的分离。 蛋白质鉴定 从蛋白质芯片对结合的蛋白质进行消化，或者事先对蛋白质混合物进行蛋白酶切处理，再结合到蛋白质芯片。结合质谱分析，能够得到消化片段的分子量，从数据库中进行检索就能够获得相应蛋白质的序列信息。 分子间作用 预先对芯片的点进行处理，偶联抗体或者其他蛋