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第十三章 目的与意义 基本要素 Main contents For Example For Example FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RACE 1978年Nobel 医学与生理学奖 The Nobel Prize in Medicine was awarded, in 1978, to Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton Smith for the discovery of restriction endonucleases. Their discovery lead to the development of recombinant DNA technology that allowed, for example, the large scale production of human insulin for diabetics using E. coli bacteria. Over 3000 restriction enzymes have been studied in detail, and more than 600 of these are available commercially and are routinely used for DNA modification and manipulation in laboratories. 第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作 工具酶(Tool enzymes )---- 一、RE在基因克隆中用于切割DNA RE (restriction enzyme, restriction endonuclease )----限制性核酸内切酶，限制酶，能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定末端的酶 二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶 其他工具酶----用于对DNA分子进行多种操作，也叫修饰酶 Klenow片段 第二节 基因克隆需要特定的DNA载体 一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒 (一)质粒是常用的克隆载体 (二) 噬菌体经过重组也可以携带外源 DNA (四) 粘性质粒适合克隆较大的DNA片段 (三) M13噬菌体适合制备单链DNA (五) 病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞 二、表达载体将外源基因带入宿主并表达 Expression vectors Concept: (一) 原核表达载体适于原核细胞表达外源基因 原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制 (二) 真核表达载体适于真核细胞表达外源基因 第三节 基因克隆过程包括五个基本部分 Gene cloning process 一、采用不同方法获取目的基因 Methods to get a target gene: (一) 从基因组文库中获得目的基因 随机文库克隆数目计算 随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库，有： 植物基因组大小 及克隆文库所需噬菌斑数 (二) 从cDNA文库中获得目的基因 (三) 利用PCR技术获得目的基因 (一) 转化是直接将DNA导入细菌的方法 (二) 感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主 (三) 转染是将外源DNA导入真核细胞的方法 第四节 真核细胞基因转染 (一) 利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选 第五节 利用重组DNA技术进行基因改造 第六节 克隆基因在适当宿主细胞的表达 第七节 电子克隆辅助基因克隆 Summary The basic elements for gene cloning For example (Genome based) 以小麦胞质G-6-PD cDNA序列为信息探针 回文诗欣赏 ? 有一次苏轼专程上门拜访秦观。家人告诉苏轼，他出外游玩，很可能上佛印和尚寺里去了。于是苏轼写信去询问他的情况。秦少游见苏轼来信后，便写了一封只有14字的怪信遣人带回给苏轼。信上的14个字排成一圈： 暮已　　赏时　　　　　花醒　　　　　　　　归微　　　　　　去力　　　马酒　如飞 回文诗欣赏 清代女诗人吴绛雪写的咏四季的四首回文诗，《春夏秋冬》，每首仅用十个字，却是七言绝句. 一首诗从10个字中回环出来，描写四季自然特色分明，光色陆离，让人回味无穷。被世人誉为回文诗珍品。其中，《夏》更是公认的一枝独秀。 (三) PCR技术适合进行基因的定点诱变 Principle(两对引物，三次PCR): 一对常规引物a、d + 一对带诱变点的引物b、c a + b 及d + c分别扩增出两个带突变点的片段 上述两个片段等量混合，变性、退火 用Klenow DNA聚合酶补齐 利用a、d引物对进行PCR扩增，即得所需片段 5’ 5’