DNA指纹图谱分析.docxVIP

DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 三. 实验材料和试剂 1. DNA样品 2.化学试剂和溶液 （1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 （2）EcoRⅠ限制性内切酶 （3）PstⅠ限制性内切酶 （4）电泳缓冲液（50×TAE）　　Tris 242g　　冰醋酸 57.1ml　　EDTA（0.5mol/L pH 8.0） 100ml　　使用时用蒸馏水稀释50倍。 （5）样品缓冲液（DNA sample loading dye）　　0.25%溴酚蓝　　0.25%二甲苯青　　40%（W/V）蔗糖 （6）溴化乙锭（EB） 10mg/ml （7）琼脂糖agarose（电泳级） （8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢ DNA markers 3. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。 四. 实验步骤 1. DNA样品的制备 采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA。 由于一般采集的样本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技术扩增出完整的基因组DNA或者特定的高可变位点，以此制备出的DNA样品备用。 2. DNA样品的酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1小时，取出备用。? 3. 酶切产物的琼脂糖电泳 （1）在100ml电泳缓冲液（1TAE或0.5TBE）中加入1g琼脂糖，加热熔化，注意观察，当心煮沸的液体溢出！当凝胶冷却至60℃左右时加入5ul溴化乙锭溶液（终浓度为1ug/ml），充分混匀。 （2）先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在5mm左右）。 （3）在凝胶完全凝固后（室温放置30～45分钟），小心移去梳子和透明胶带，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（液面超过胶带约2～3mm）。 （4）取已制备好的酶切DNA样品，加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物，对照以及酶切DNA样品各5～10ml。 （5）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用50～100伏），电泳40～60分钟（注意：DNA样品从负极??正极泳动）。 4. 结果观察与分析 关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA样品是同一个样品，找出罪犯。 五. 注意事项 （1）酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。 （2）进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。 （3）溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须带手套 。实验结束后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。