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普鲁兰酶 粮食油脂及植物蛋白工程专业 -----孙江，张丽 普鲁兰酶 系统名为普鲁兰6- 葡聚糖水解酶（Pullulan 6-gluca-nohydrolase），又叫作茁霉多糖酶、支链淀粉酶、淀粉-1，6-葡萄糖苷酶 普鲁兰酶分类 根据水解的糖苷键差异，普鲁兰酶可分为 ：I 型普鲁兰酶( 专一性水解普鲁兰的 а-1，6-糖苷键) 和Ⅱ型普鲁兰酶( 可水解普鲁兰的 а-1，6-糖苷键以及其他多聚糖的 а-1，4-糖苷键)2 种 普鲁兰酶的功能 在食品加工行业中, 大部分淀粉质原料中支链淀粉占总淀粉质量约为 75 %~85 %，支链淀粉中含有 4% ～5% 的 а-1，6-糖苷键.它能专一催化支链淀粉多糖的α-1,6-糖苷键水解，从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉，终产物为麦芽三糖 将该酶与葡萄糖淀粉酶等配合使用,可使淀粉充分糖化。因此在以淀粉质为原料的工业和新生物能源工业中，普鲁兰酶的应用大大提高了原料的利用率，降低了生产成本。 普鲁兰酶的研究历史 1961 年德国学者 Bender 和 Wallenfels在研究一株产气杆菌（Aerobacter aerogenes）时首次发现的，它的特异性底物是普鲁兰多糖。此后陆续发现许多微生物也可以合成此酶 1966年，Wallenfels和Bender又对该酶进行了分离纯化和性质研究，通过实验，确定其良好的热稳定性。 丹麦芬兰诺瓦公司在1980年初获得一株嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌，此菌产生的普鲁兰酶可耐pH值4.5，最适反应温度60℃。1983 年在欧洲和日本市场同时商业化销售，迄今仍是销售最大、应用最广的品种。 1986年,日本的義行高崎报道了一株亦能产生耐热,耐酸普鲁兰酶的菌种 1987年,德国报道了一株能同时产α—淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃), 最适温度 60～70 ℃,在pH4.5～6.0有较高的活性,在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域 普鲁兰酶作用机制图 酶的分离纯化方法 由于不同来源的菌种所产的普鲁兰酶的分泌位置、等电点及分子量等生理生化特点有较大的不同，所以纯化方式也各不相同，没有固定的规则.常用的实验室分离纯化方法可以分为 2 个过程: 发酵液的浓缩和酶的分离纯化。 粗酶的实验室制备一般采用(NH4)2SO4, ,即离心去除细胞的发酵液中加入一定饱和度的(NH4)2SO4,收集沉淀并干燥。 酶的纯化方法。以蜡状芽孢杆菌覃状变种所产普鲁兰酶为例。经过离心去除菌体,硅藻土吸咐,NaCl洗提,(NH4)2SO4沉淀、透吸及上葡萄糖凝胶(Sephadex )G—100柱，达到了电泳纯。经Sephadex G—200凝胶过滤法测定分子量,此普鲁兰酶分子量为110,000±20,000 各主要产酶菌种的普鲁兰酶酶学特性 生产菌种 蜡状芽孢杆菌覃状变种(B.cereus Var Mycoides) 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌(B.Acidopullyticus) 枯草芽孢杆菌(B.subtilis) 耐热产硫梭菌(Clostridium. Thermosulfurogenes) 最适作用pH 6～6.5 4.5～5.5 7.0～7.5 4.9～5.2 最适作用温度 50℃ 60℃ 60℃ 70℃～75℃ 酸碱稳定性 pH6～9稳定,偏向碱 pH4. 9，50℃和60℃3天后,残余活力为100%和89%;pH4～8.5，4℃，24小时稳定 pH5.0～8.5稳定,pH5. 0时有大于50%酶活 pH4～9 温度稳定性 50℃以下稳定 55℃以下稳定,葡糖醇(葡萄糖类似物)对该酶抗热性有增强作用 55℃以下稳定 5℃～90℃时稳定;在75℃有100%酶活,通风条件下无金属离子影响时,加入淀粉可增强热稳定性 生产菌种 蜡状芽孢杆菌覃状变种(B.cereus Var Mycoides) 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌(B.Acidopullyticus) 枯草芽孢杆菌(B.subtilis) 耐热产硫梭菌(Clostridium. Thermosulfurogenes) 金属离子影响 Ca2+可增强热稳定性,大部分金属离子并不能增加酶活,Fe2+、Hg2+、Ag+抑制酶活 Ca2+可增强热稳定性 Fe2+、Fe3+抑制酶活 底物特异性 水解普鲁兰糖为麦芽三糖,水解B—极限糊精为麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖;不作用潘糖、异麦芽糖、异麦芽三糖 水解普鲁兰多糖、可溶性淀粉、可溶性糯米淀粉、糖原、B—极限糊精、麦芽糖基—A—环状湖精;不作用麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、异潘糖和右旋糖酐 水解普鲁兰糖为