分离组织膜蛋白的方法技术分析.docVIP

分离组织膜蛋白的方法： 1）取组织适量，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2）1000g下4℃离心10min，取上清液转入另一离心管中。 3）105000g，4℃离心 1 hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4）收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M surcose，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，1％ W/V SDS ,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。 2、分离膜蛋白的方法（操作） 1）分离细胞膜蛋白的方法： 1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。 2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。 3 取上清12000转4度离