CRISPR-Cas9基因敲除小鼠教程详解.pptx

CRISPR-Cas9KnockinMiceforGenomeEditingandCancerModelingCRISPR-Cas9系统的原理crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。2016-11-242CRISPR-Cas9系统的原理2016-11-243sgRNAtarget通过设计sgRNA来确定剪切位点设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶Cas9的局限性受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚胎层面的实验。本实验采用Cre-dependentRosa26Cas9knockinmouse克服了这个局限性。使得CRISPR-Cas9应用更广泛。2016-11-244Cre-dependentCas9Rosa26targeting矢量图2016-11-245荧光蛋白Rosa26，使转录可被诱导转入Cas9后与野生小鼠对比2016-11-2462016-11-247神经系统荧光对比三种实验测试效果：三种转接方法：纳米粒子、腺病毒转导、慢病毒转导。三个系统（器官）：免疫、神经、肺（癌）。2016-11-248一、慢病毒转入树突状细胞2016-11-249——转入树突状细胞实验过程2016-11-2410通过荧光蛋白EGFP可以鉴别Cas9是否转导成功设计了两个剪切位点2016-11-2411有转入目的基因的小鼠大多细胞目的基因发生移码突变，目的基因转录和翻译都明显下调。2016-11-2412二、腺病毒转入大脑皮层额叶2016-11-2413目标基因是NeuN目的基因发生的改变2016-11-2414缺失一位缺失多位插入一位插入多位2016-11-2415荧光显示含有Cre/Cas9的组织中NeuN表达明显减少，而非转入非目标的sgRNA则目标蛋白无影响NeuN被破坏的比例十分大2016-11-2416Indel=insertions(插入)anddeletions(删除)多数为两个等位基因都被破坏，且其中多为移码突变。2016-11-2417三、腺病毒转入肺2016-1111-2419sgKrassgp53sgLkb1Kras同源修补P53的基因变化多为移码突变2016-11-2420Lkb1的基因变化多为移码突变2016-11-2421Kras的基因变化2016-11-2422P53和Lkb1不断被损坏，Kras则被修补变得越发优势2016-11-2423最终肺中出现肿瘤2016-1111-2425总结事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中，可以大大扩展Cas9的用途。以后用此方法可以更好的对基因进行修整，已达成更多的实验，为人类医学和生物学作出贡献。2016-11-2426Thanks！