HPLC-DAD测定5种苯类化合物实验介绍.docVIP

HPLC-DAD测定5种苯类化合物（实验报告） 环境工程 刘鹏 123351 一、实验目的 1．掌握液相色谱分析法的基本原理。 2．基本了解液相色谱（1200LC）硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定数据采集分析的基本操作。 3．4．掌握液相色谱定性、定量方法。二、实验原理 分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。 C18柱-反相HPLC（reversed phase HPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。 二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测Agilent 1200 DAD全扫描波长范围为190nm-950nm） Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。三、仪器及试剂 1、仪器：Agilent 1200 LC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 检测器、C18色谱柱 ，稳压电源 2、试剂： 色谱级乙腈、甲醇；Miniport超纯水；标准品；实际测试水样 1.进样器 洗针进样 进样量 20.0μL 2.设置泵 流速 1.5ml/l 溶剂 停留时间 7.0min H2O 20% 后运行时间 2.0min 甲醇 80% 时间表 时间 %C 80 80 1.01 100.0 7.00 100.0 3.柱温箱温控 温度 35oC 4．DAD信号 254 4 360 100 所需灯 280 16 360 100 紫外灯 光谱储存全部范围：190-400nm 五、实验步骤 5.1上机准备 根据待测物要求配制5个浓度点标准样品，待测水样1-2个（样品需要前处理）， 查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液相色谱分离条件。 检查线路是否连接完好。检查流动相、洗针液是否充足，不足则根据要求添加。 有机流动相必须为进口HPLC 级，水相可使用Millipore 纯水机出水或娃哈哈屈臣氏纯净水。所有流动相在使用前均需用0.2μm 的滤膜过滤（水和缓冲液用水相滤膜,有机相用有机相滤膜），其中水相需每天更换以保持新鲜。 标样和样品在使用前必须用0.2μm 的针头式滤器（进口非分装）过滤。 将样品放置在样品托盘上，并记录相应的位置。且第一个和最后一个样品为不含营养盐的流动相，用于清洗进样系统及管路。 （其中有下划线部分为实验课程中未涉及部分） 5.2开机 1．打开稳压电源（指针指示220V），打开仪器面板Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 电源开关。 2．打开电脑，双击工作软件Xcalibur，在status 状态栏下看到AS、PDA、Pump 三项显示ready to download；仪器面板灯除Pump 部分的RUN 灯呈橙色外，其余灯均为绿色，表明仪器及通讯正常，可进行下一步操作。 3． purge 管路系统，直至无气泡。方法如下：打开Accela Pump 左侧的门，将塑料针筒接到purge 阀的输出管上，逆时针拧松purge 阀；将Accela pump 中的purge 阀拧到左边；点击软件双击Roadmap 中Instrument Setup 图标，显示Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的Accela Pump，点击下拉主菜单中Accela Pump 栏中的direct control 跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入flow 为600μl/min，选择相应的流动相（设为100%），点击play 键开始purge，10