临床免疫实验内容讲义.doc

实验一 人外周血单个核细胞分离（4学时） （一）实验目的 掌握人外周血单个核细胞分离的原理及操作方法； （二）实验 （三）实验材料 ① 肝素抗凝静脉血；② Ficoll淋巴细胞分离液（密度为1.077±0.001）；③ D-Hanks液；④ 0.4%的台盼蓝染液；⑤器材：离心机、恒温水浴箱、显微镜、细胞计数板等。 （四）实验方法 ① 抽取抗凝血2ml，与等量D-Hanks液混匀；② 取分离液2ml，缓慢加入释血液4ml；③ 2000 rpm离心20 min，观察细胞分层情况；④ 取出PBMC，用4倍量D-Hanks液洗涤2次，每次1500 rpm离心10 min；④用10%FCS的Hanks液还原体积至1 ml，取样镜检计数；⑤细胞存活率测定：取一个1.5ml EP管，加入等量的细胞悬液与台盼蓝染液，混匀后静置5min，镜检；⑥注意事项。 细胞数/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 （五）实验结果 PBMC的计数= xxx 个/ ml；② 细胞存活率= 实验二 淋巴细胞检测（4学时） （一）实验目的 掌握免疫组化技术的原理、方法、结果判断及实际应用； 熟悉E花环形成试验和淋巴细胞转化试验的原理及结果判断。 （二）实验内容 酶免疫组化技术测定CD3+T细胞数量（操作） （1）原理 酶免疫组织化学技术是以细胞涂片或组织切片为检测对象，应用酶免疫技术对特定细胞表面抗原进行显色，通过普通光学显微镜观察，判断细胞表面有无特异抗原的表达。本实验采用鼠抗人CD3单克隆抗体，与待检T细胞表面CD3分子结合，加入二抗，即聚合辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG，通过HRP催化底物显色判断CD3分子的存在，从而确定T细胞。 （2）材料 ①人外周血单个核细胞悬液；②鼠抗人CD3单抗（武汉博士德）；③ 两步法免疫组化检测试剂盒（武汉博士德）；④ DAB显色试剂盒（武汉博士德）；⑤ 0.01M PBS（PH 7.4）；⑥器材：2 ml EP管、吸附载玻片、微量移液器、恒温水浴箱、光学显微镜等。 标本片制备：取1-2滴PBMC悬液，滴在吸附载玻片上，用一块洁净普通载玻片进行推片，制作细胞涂片，室温风干；滴加免疫染色固定液室温固定10 min；甩掉多余的固定液，浸入PBS中，冷藏备用。 封闭：5% BSA，RT 10min 免疫反应：加100μl鼠抗人CD3单抗，置湿盒内37℃ 1h，PBS洗涤，2min*3次；加100μl聚合HRP-抗鼠IgG，置湿盒内37℃ 30 min，PBS洗涤，2min*3次。 DAB显色：取1ml蒸馏水，加入ABC各一滴，混匀后加至涂片，室温，镜下控制反应时间，约5-30分钟，ddH2O漂洗终止反应。 镜检：加盖破片镜检计数。 （2）实验材料：① E花环形成试验示教片；② 显微镜。 （3）实验结果（绘图60%~80%。 （2）实验材料：① 淋巴细胞转化试验示教片；② 显微镜。 （3）实验结果（绘图补充】利用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。 成熟的小淋巴细胞（未转化）：与未培养的小淋巴细胞一样细胞直径为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 其它细胞：如中性粒细胞在培养72 h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 实验三 酶联免疫吸附试验（2学时） （一）实验目的 掌握酶联免疫吸附试验的基本原理和实际应用； 熟悉酶联免疫吸附试验的操作方法。 （）实验酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗体（抗原）包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体（抗原），最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。ELISA的技术类型有多种，常用的有间接法、夹心法和竞争法等。本实验以酶联免疫吸附试验检测乙肝三系为例，验证其这一技术进行验证，包括双抗体夹心法测HBsAg和HBeAg，双抗原夹心法测HBsAb和竞争法测HBeAb和HBcAb。 （）实验（）实验①加入待测样本：加入酶标板反应孔中，每孔100μl，置于37℃30 min。注意应做阴性对照和阳性对照。弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次1min。于吸水纸上充分拍干；②加入酶结合物酶结合物反应孔中，置于37℃作用30 min洗涤同第2步；③加入底物显色