连接粘附分子-1在人角膜中的表达和其意义.pdfVIP

·中文论著摘要· 连接粘附分子一1在人角膜中的表达及其意义 前言 角膜上皮的一个重要生理功能就是对外界生物和化学损伤起屏障作用。角膜 上皮细胞层为复层上皮，细胞分为3种：基底细胞；翼状细胞；表层细胞。表层 细胞之间的紧密连接与细胞膜一起构成有效防线阻止液体和其他化学物质进入角 膜深层，使眼免受病原微生物及各种物理化学因素变化的影响，同时也防止泪液 及其化学成分的渗透。紧密连接是细胞与细胞之间的连接在调节旁细胞通路的通 透性上起至关重要的作用。它使相邻细胞两层质膜紧紧靠在一起，中问没有空隙， 粘着牢固。同时还限制细胞顶侧的脂质成分和基侧的膜蛋白质成分的流动，在产 生和维持细胞极性方面也起到重要作用。 紧密连接主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成，同时细胞骨架(主要 是微丝)也参与紧密连接的组成。目前发现的跨膜蛋白有三种：闭合蛋白 adhesionmolecules． (claudin)，咬合蛋白(Oeeludin)和连接粘附分子(junctional 分子，并通过CHO转染证实其在细胞连接中起重要作用，因此命名为连接粘附 性细胞外的Ig样的蛋白域，远膜端V-型，近膜端c．型Ig样域，一个跨膜区和细 胞内短尾。在c末端有一个II型PDZ结合域能与含PDZ的分子相结合参与紧密 连接的构成。PDZ是蛋白质之间结合的模块，识别与它相结合的蛋白质的C．末端。 含PDZ域的蛋自质多是骨架蛋白，与其他蛋白质结合形成质膜下大的蛋白质复合 结构，参与紧密连接的构成。同时JAM．1还参与紧密联结创伤后的再修复及上皮 屏障功能的调解。 但JAM．1不仅表达在能够形成细胞连接的上皮、内皮细胞，同时存在于血小 板和免疫系统的细胞中，如鼠的血小板和淋巴系统中表达MHCII型抗原的细胞 中，在人类则表达在循环的红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板 表面。实验证明它在多种细胞活动中发挥作用，包括参与紧密连接的构成、白细 胞游走、血小板活化、新生血管形成及与病毒结合等。但JAM．1是否存在于人的 角膜细胞连接中，尚未见报道。咬合蛋白(Occludin)是最早发现的与紧密连接相 关的跨膜蛋白，参与紧密连接功能的调节，并且在角膜上皮细胞表达。本实验旨在 检测JAM-1在正常与病理情况下人角膜各层中的表达；并与咬合蛋白分布特点相 比较。 材料与方法 1、标本来源 正常角膜来源于北京医科大学第三临床学院眼科中心眼库及日本顺天堂大学 医学部眼库。 病变角膜来源于北京医科大学第三临床学院眼科中心2005年5月．2007年2 月、中国医科大学附属盛京医院2006年3月．2007年1月及日本顺天堂大学医学 部眼科2005年4月．2006年3月角膜移植或眼球摘除手术切除的角膜组织。 2、细胞培养及RT-PCR corneal 人角膜上皮细胞(Humanepithelialcells，HCEC)、基质细胞、内皮细 胞培养至细胞融合。弃上清，加入Tdzol试剂提取细胞RNA。以逆转录后获得的 p 1uL。 eDNA为模板，PCR扩增目的基因。PCR反应：总体积20L，模板eDNA 反应条件为：94℃5min-,94℃60s，54--60C30～60s，72℃60s 30循环÷ 72‘C la u 10min，4C。凝胶电泳检测：PCR产物各取8l，加2 110X缓冲液，混 察结果，拍照。 3、流式细胞仪检测JAM-1蛋白表达 laL 取培养细胞lxl06个溶于100 1．t PBS中，制成细胞悬液，加入1