毛细管电泳总结.ppt

第一节 概述 气相色谱虽然分离效率、选择性、灵敏度都很高，但是它只适用于热稳定性好、易挥发的物质。 高效液相色谱虽然可以分析热稳定性差、难挥发的物质，但是缺乏高灵敏度的通用型检测器。对于大分子物质因其分子扩散系数小、传质阻力大，使柱效率大大降低，以至于难以分离相对分子质量大于2000的物质。 经典电泳技术操作繁琐费时、定量困难，且很难满足现代生命科学研究的要求。 1807～1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象。 1907年，Field和Teague首次用电泳成功分离了白喉毒素和它的抗体。 1937年，瑞典科学家将人血清提取的蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端加电压，第一次分离出白蛋白和?、?、?-球蛋白。 Tiselius还制成了第一台电泳仪并进行了第一次自由溶液电泳。他因对电泳技术的发展和应用的巨大贡献而获得1948年诺贝尔化学奖。 自由溶液电泳的分离效率受焦耳热的限制，只能在低电厂强度下进行操作，使分析时间和分离效率很低。 1967年，Hjerten最早提出了用小内径管在高电场下进行自由溶液的电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas发表了划时代的研究工作，用75um内径石英毛细管进行电泳，电迁移进样，荧光柱上检测丹酰化氨基酸，达到400000块/m理论塔板数的高效率。从此跨入高效毛细管电泳的时代。 电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场作用下向相反方向迁移的现象，利用此现象对物质进行分离分析的方法，称为电泳法。 毛细管电泳（capillary elecrophoresis, CE）是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。 1. 仪器简单，操作方便，容易实现自动化。 2. 分离效率高，柱效可达105~107块/m。 3. 分析速度快，几十秒～几十分钟。 4. 实验成本低，溶剂和试样消耗极少。 5. 操作模式多，分析方法开发容易。 6. 应用范围极广。 三、毛细管电泳的几种模式 1. 毛细管区带电泳 （capillary zone electrophoresis，CZE） 溶质在毛细管内的电解质溶液中以不同速度迁移而形成一个一个独立的溶质带的电泳模式，其分离基础是淌度的差别。 特点：简单，但不能分离中性物质。 2. 胶束电动色谱 （micelle electrokinetic chromatography，MECC） 在操作缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度的表面活性剂。 特点：不仅分离离子型化合物，也能分离中性化合物。 3. 毛细管凝胶电泳 （gel capillary electrophoresis，GCE） 毛细管内填充凝胶或其它筛分介质，如交联或非交联的聚丙烯酰胺。电荷/质量之比相等但分子的大小不同的分子，经过凝胶聚合物构成的网状结构时受阻力不同，迁移速度不同，从而得以分离。 4. 毛细管等电聚焦 （capillary isoelectric focusing，CIEF） 根据等电点差别分离生物大分子的电泳技术。两性物质在等电点以电中性状态存在，淌度为零。 所谓“聚焦”是当两性物质在毛细管中形成pH值梯度时，不同等电点物质在外电场作用下，分别向其等电点的pH值范围迁移。不同的两性物质的等电点不同，聚焦的pH值不同，可以形成一个个独立的溶质带而彼此分开。 5. 毛细管等速电泳 （capillary isotachophoresis，CITP） 用两种淌度差别大的缓冲体系分别构成前导离子和尾随离子，将试样像夹心饼干一样夹在二者之间，在一次电泳中可以同时分离正离子或负离子。 6. 毛细管电色谱 （capillary electrochromatography，CEC） 用装有固定相的毛细管柱，以电渗流为驱动力，使样品在两相间进行分配的色谱。这是把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术。 第二节 毛细管电泳理论 一、电泳法的基本原理 二、电渗和电渗流 电渗：液体相对于带电的管壁移动的现象。 电渗流：电渗现象中液体的整体流动，简称EOF。 石英的等电点约为1.5，在常用缓冲溶液中(pH2)，管壁的硅羟基开始部分解离成-SiO-，使管壁带负电。由于静电引力，电解质溶液中的阳离子被吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电层。 三、电泳淌度 绝对淌度 表观淌度 在毛细管电泳中，同时存在着电泳流和电渗流，粒子在毛细管内的运动速度是这两种速度的矢量和： 【例】用高效毛细管电泳分离3种维生素(阳离子、中性分子和阴离子) , 测得的迁移时间分别为38.4s, 50.7s和93.1s，已知毛细管总长度为58.5cm，有效长度为50cm，外加电压