1聚合酶链反应.ppt

* RT-PCR操作需注意的问题： 1.模版RNA应严格纯化，； 2.避免RNA酶污染； 3.所用与实验有关的物品，需用0.1％的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。 * 增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。 * 2. 巢式PCR（nest PCR） 　此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 　　　除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。 * 巢式PCR 采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。 P1上 P1下 P2上 P2下 P1上 P2上 * First round primers First round PCR Second round primers Second round PCR Gene of interest * 在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。 3、多重PCR * 定量PCR 测定靶基因的原始拷贝数 目前常用Taq man法.该法的原理是:反应底物中加入荧光探针,探针中的荧光基团与淬灭基团距离近,荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭,随着反应的进行,结合在靶序列上的荧光探针被Taq酶水解,荧光基团发射的荧光,被监测系统接收。据荧光强度,计算靶基因的原始拷贝数. * 实时定量PCR技术原理 * SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的游离的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 * 原位PCR 将组织或细胞固定于玻片上，经消化处理后，在玻片上滴加PCR反应系统，覆盖密封，置入专用的PCR扩增仪，进行PCR反应。PCR反应结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。 用显微镜观察结果。 该方法可分辨鉴定带有靶序列的细胞，又可标出靶序列在细胞内的位置。 * GenBank网址： 使用Blast程序，输入引物序列，等待结果报告 * 第九章聚合酶链反应（PCR）参见教材第137页 * 一.概 述 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。 数小时达107-108倍 1985年，Centus公司Kary Mullis 发明 1993年因此获诺贝尔化学奖 * PCR扩增仪 * 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物复性 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 * 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 再变性 * 再复性 P1 P1 P2 P2 再延伸 * P1 P1 P2 P2 短片段以指数形式扩增 长片段以线性形式扩增 最终主产物片段长度在P1-P2之间 * PCR循环的主要参数： 1. 预变性：92°C--95 °C， 2--5min 2. 变性： 92°C--95 °C，30s-1min 3. 复性： 40 °C--60 °C，20s--2min 4. 延伸： 70 °C--75 °C，30s--3min 5. 总延伸：72 °C， 7min * 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C * PCR扩增条件 94℃, 5min 94℃, 1min