第六章、放射免疫讲述.ppt

第六章 体外分析技术 体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称，它是利用某种特异性结合剂与被测物和标记物进行结合反应，从而对极微量物质进行定量分析的分析技术。 1960年Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法（RIA）测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定的新时代，是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例介绍这类方法的基本原理及方法特点。 第一节 放射免疫分析 一、基本原理：放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类技术，其基本原理为竞争性抑制。即：放射性标记抗原和非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）共同与特异性抗体发生可逆性结合，如图8-1。这种竞争可用以下反应式来表达： Ag + Ab → AgAb+Ag*↓Ag*Ab 式中Ag *代表标记抗原，Ag代表非标记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag * Ab代表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标记抗原抗体复合物。 放射免疫分析的几种标准曲线图： 可以看出，这是一条随剂量增加而下降的直线。这种方法的缺点是：由于剂量取对数，0剂量在拟合时不用，所以灵敏度有损失；如果反应系统不是理想模式，用本方法处理将有较大偏差。 2、四参数Logistic模型 四参数Logistic模型是国际原子能机构（IAEA）和世界卫生组织（WHO）推荐的数据处理模型，是对Logit-Log模型的发展。其通式为： 其中X是抗原剂量，Y是结合%，a、b、c、d为四个参数。对RIA来说，a可取实验所得的最大结合率B0，b可取同一批数据用Logit-Log法作线性回归所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原浓度ED50，d可取实验所得NSB。四参数Logistic模型的图形如图： 3、其他拟合模型 如四参数单位点作用模型的稳定性较好，个别标准管出现坏点对拟合结果的影响较小；还有二次多项式拟合法、折线拟合法等。应当指出，不论采用何种数学模型进行曲线拟合，实验的结果应该是相同的或相近的，都不能改善实验过程低劣所带来的影响。 六、RIA的分析误差和质量控制 RIA是一类高灵敏度的超微量分析技术，易受各种因素的影响而使检测结果失真。因此，质量控制体系应包括生产及使用两个重要环节。作为生产厂家，应建立严格的质量检测程序，以保证进入市场的产品都符合质量要求，这是首要环节。作为用户则应建立严格的质量控制体系，以保证检测的质量。根据不同的目的，质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价。 （一）误差的来源 按误差发生的统计学性质可将其分为： 1、系统误差（systematic error） 这种误差常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。 （1）方法误差，如标准品稀释体积不正确；（2）仪器和试剂误差，如仪器状态不佳；量器不准； （3）操作误差，如不正确的操作习惯等。 系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error） 这种误差是由偶然因素所引起，误差的出现是随机的，与真值的偏差是双向的。常见的原因如加样误差，由分离剂或离心机造成的错分误差等。 （二）实验室内部质量控制（internal quality control） 实验室内部质量控制侧重对检测质量的控制，它保证从收集样本开始到发出报告为止的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生的原因，找出纠正的办法，以确保检测的质量。常用的评价指标有精密度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性。 1、精密度（precision） 精密度是指在相同的条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度，即重复性。RIA系统的精密度是首先和随时应考虑的，是最重要的质量参数。评价方法如下： （1）、标准误差（SD）和变异系数 2、准确度（accuracy） 准确度是指测定值与真值的符合程度。考核符合程度的实践往往需要多份测定的结果进行计算。准确度、精密度之间的关系： 1．准确度、精密度均好。2．准确度较好，精密度差。3．准确度差，精密度好。4．准确度、精密度均差。 实验室内常用回收实验，健全性试验，“零”水平测定等评价方法的准确度。 附回收率（recovery rate）的测定： （1）回收率：回收率是反应测定值偏差的质控指标，测定方法是设回收管和对照管，对照管中加入待测样品，回收管中加入待测样品和已知量的分析物，经过测定全过程，比较已知量和测得量之间的一致程度，理论上回收率一般为90%-110%之间，回收率的计