食品安全分析9.ppt

二、氨基酸自动分析仪分析 原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 操作步骤 样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。 称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。 水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15mL（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4 滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50mL容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用 1～2mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mL pH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。 测定：准确吸取0.200mL混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5mL，此标准稀释浓度为5.00 nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定氨基酸含量。 原理 将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物——三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAA）的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。 三、气相色谱法 高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。 由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常用配置。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。 四、高效液相色谱法 1、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？ 2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？ 3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？ 4、试述氨基酸态氮的测定原理。 5、结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？ 思考题 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1 min后关掉热源 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量；氢氧化铜在70～90℃时发黑。 （二）微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L 可用微量滴定管 3、蒸馏装置见 159 页图 10-2 。 10-2 4、说明与注意: ①蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升 ②20g/L硼酸吸收液每次用量为25 mL，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂两滴。 ③在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。加碱要充足，操作要迅速，漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。 （三）自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的： 双缩脲法 紫外分光光度法 染料结合法 水杨酸比色法等 二、其他测定方法 1、双缩脲法： 双缩脲的性质：当脲被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应 测定原理：蛋白质分子中肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。 特点：简单快速，灵敏度低，常用于生化领域。 2、分光光度法