人工诱发单倍体及其应用剖析.ppt

花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程. 花粉培养技术 1、取材时期：四分体时期到单核早期。 花粉培养技术 2、花粉的分离： 1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 花粉培养技术 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 花粉培养技术 4、花粉的培养 平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。 看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。 看护培养图解  1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 花粉植株的形态发生方式 烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株  2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 花粉植株的形态发生方式 愈伤组织转接种到再生培养基 愈伤组织分化形成再生植株 部分花药产生愈伤组织 接种在平板上的水稻花药 水稻花药培养的愈伤化发生途径 第五节 单倍体植株的鉴定和二倍化的方法 1. 间接鉴定：通过观察染色体倍性变化后而表现出的容易识别的形态特征等而初步判断的鉴定方法。 ①植株形态特征的观察； ②叶片气孔保卫细胞的测定； ③花粉粒的鉴定； ④气孔密度测定。 一、单倍体植株的鉴定 2. 直接鉴定：染色体数目的检测，也是最准确的倍性鉴定方法。 ①根尖的鉴定； ②幼穗或花蕾的鉴定； 一、单倍体植株的鉴定 秋水仙素 1. 浓度的选择 2. 处理时间的选择 3. 助渗剂使用 二、单倍体植株的二倍化 花粉植株的倍性及染色体加倍 1. 对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性： ①体细胞干扰 ②生殖细胞的自发加倍 2. 花粉植株的倍性： 单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体 3. 影响非整倍体植株出现的频率的因素： ①植株的种类 ②接种花粉的发育时期 ③培养基中激素的浓度和种类 ④花粉植株发生的方式 ⑤愈伤组织继代培养时间长短 花粉植株的倍性及染色体加倍 花粉植株的倍性及染色体加倍 4. 单倍体植株的鉴定 1）形态学鉴定 2）染色体分析 5. 单倍体植株的二倍化 ①小苗浸泡法 ②生长锥处理 ③培养基加倍 * * 小孢子母细胞经减数分裂产生4个一群的单倍体细胞，这个发育时期称为四分体（tetrad）。 * 由四分体刚刚解体成单细胞这一阶段的单倍体细胞称为小孢子。小孢子继续发育，其核进行第一次分裂后形成1个精核（generative nucleus）和1个营养核(vegetative nucleus)的二核细胞；营养核再分裂一次形成2个精核和1个营养核的三核细胞。我们把这种二核或三核细胞称为花粉。在花粉培养过程中，通常是取花粉发育处于单核靠边期和双核早期阶段的花粉细胞进行培养。 * 可以避免花药壁、花丝和药隔等体细胞组织的干扰，具有单细胞、单倍性和较高同步性等特点 * 花药供体植株的生长条件对花药培养反应听影响委大。水稻、小麦、大麦等主茎穗诱导率明显高于分蘖穗花药愈伤组织的诱导率。 * 由四分体刚刚解体成单细胞这一阶段的单倍体细胞称为小孢子。小孢子继续发育，其核进行第一次分裂后形成1个精核（generative nucleus）和1个营养核(vegetative nucleus)的二核细胞；营养核再分裂一次形成2个精核和1个营养核的三核细胞。我们把这种二核或三核细胞称为花粉。在花粉培养过程中，通常是取花粉发育处于单核靠边期和双核早期阶段的花粉细胞进行培养。 * * 培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件，培养基成分是否合适往往是决定花药培养成功的关键因素，而且还影响发育的方式。 激素，在此花药的诱导脱分时，需要有较适宜的细胞分裂素和生长素配比，从而有效地诱导花粉细胞启动分裂，同时又控制二倍体细胞的分裂。高浓度的2，4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，从而增加了二倍体细胞发育的机会。 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物