分子克隆技术第一部分.pptVIP

外源DNA 4 ?l 目的载体DNA 4 ?l 10 ? buffer 1 ?l T4 ligase (1U/?l) 1 ?l 连接反应体系： 16 oC 水浴保温过夜 Total 10 ?l 感受态细胞的制备及质粒的转化 转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 感受态细胞的制备 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。 将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法： CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 ～ 107转化子/?g DNA。 电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010 转化子/?g DNA； 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。 操作注意事项 前夜接种受体菌（DH5?），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）； 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； CaCl2感受态细胞的制备（一） 4℃下4000rpm冷冻离心10分钟； 弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 4℃下4000 rpm冷冻离心10分钟； 弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮， 4℃下4000 rpm冷冻离心10分钟； 弃去上清，加入20?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 细胞悬浮液可立即用于转化实验,48小时内使用，可以暂时保存在4℃. 长时间保存，需添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。 CaCl2感受态细胞的制备（二） 操作注意事项 密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。 转化步骤 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中250 ?l Amp，250 ?l X-gal，25 ?l IPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中； 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3管感受态细胞分别加DNA连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 复苏：每管加400 ?l SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏； 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板； 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子） 注意： 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37 ℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将?－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 电转化感受态细胞的制备（一） 前夜接种受体菌（DH5?），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 取1ml过夜培养物于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）； 将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作 吸取1.5ml