SDSPAGE电泳技术的应用说课.pptVIP

SDS电泳技术的应用 姓名：崔光彩 学号： PAGE合成原理 浓缩胶与分离胶 连续电泳系统和不连续电泳系统 实验原理 分析计算 相关函数： 参考论文 实验原理：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。 分析计算：在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。 相关函数： 1）分子量计算 logMW=K·bx MW:分子量 K、b：常数 X:迁移率 2） 迁移率计算 m= m:迁移率 d：谱带移动距离 l:凝胶有效长度 v:电压 参考论文 《藏北3种裸鲤同工酶的电泳分析及物种分化的探讨》 目的：对藏北高原3种裸鲤的乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和脂酶(EST)进行电泳分析研究其物种分化 电泳结果 电泳结果分析表明，色林错裸鲤(G．selineuoenais)与错鄂棵鲤(G．cI m)之间较之于与纳木错裸鲤(c．nan~nsis)有更近的亲缘关系。 论文原文 * 聚丙烯酰胺凝胶的合成原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。丙烯酰胺的单体形成长链，由N,N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而交联。 Copolymerization of acrylamide with methylenebisacrylamide 单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 浓缩胶与分离胶 a.浓缩胶 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快（先行离子），甘氨酸根离子最慢（随后离子），蛋白质居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区（高电位梯度区），而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。（浓缩效应、电荷效应、较弱的分子筛效应） b.分离胶 又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可分为均一胶和梯度胶。（分子筛效应、电荷效应） 连续电泳系统和不连续电泳系统 a.连续系统：电泳系统使用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液、电极缓冲液），且PH值恒定，只是离子强度不同的区带电泳。加样时必须加成很小的一条带，分辨率不高，但易配制。 b.不连续系统：使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先缩成一窄带，然后再在一定浓度(或一定浓度梯度)的分离胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。 *